Производство биоудобрений для сельского хозяйства

 

Кафедра «Экология и охрана окружающей среды»

 

Принята         Проверена

«__»________2014 год     «___»________2014 год

___________________     ____________________

Подпись                                     Подпись преподавателя

 

 

 

КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА

по дисциплине:

«Основы микробиологии и биотехнологии»

 

 

 

Выполнил:

 

 

 

Проверил:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Задание 12

1. Хранение  микроорганизмов.        3-10

2. Методы  учета численности бактерий.                                                     11-14

3. Производство  биоудобрений для сельского хозяйства.                        15-24

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Хранение микроорганизмов.

Микрооргани́змы, (микро́бы) — собирательное название группы живых организмов, которые слишком малы для того, чтобы быть видимыми невооружённым глазом (их характерный размер — менее 0,1 мм). В состав микроорганизмов входят как безъядерные (прокариоты: бактерии, археи), так и эукариоты: некоторые грибы, протисты, но не вирусы, которые обычно выделяют в отдельную группу. Большинство микроорганизмов состоят из одной клетки, но есть и многоклеточные микроорганизмы, точно также как и есть некоторые одноклеточные макроорганизмы, видимые невооружённым взглядом, например Thiomargarita namibiensis, представители рода Caulerpa (являются гигантскими поликарион(ами). Изучением этих организмов занимается наука микробиология.Необходимым условием успешной работы с микроорганизмами является правильное поддержание их с целью сохранения не только жизнеспособности клеток, но и таксономических, а также любых других, важных для исследователя свойств. Общего метода, одинаково пригодного для хранения многочисленных и разнообразных групп микроорганизмов, пока не существует. Поэтому в крупных коллекциях разные группы микроорганизмов сохраняются различными методами. Кроме того, чтобы исключить возможность потери микроорганизма, каждый штамм сохраняется не один, а несколькими способами.

К числу наиболее распространенных способов хранения микроорганизмов относятся периодические посевы на свежие питательные среды, сохранение культур на питательные среды под вазелиновым маслом, хранение клеток в лиофилизированном состоянии. Значительно реже микроорганизмы сохраняют при низких или сверхнизких температурах, в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлористого натрия, на адсорбентах в высушенном состоянии. Выбор метода хранения во многом зависит от целей, для которых используются микроорганизмы, а также от имеющегося в распоряжении исследователя оборудования.

Периодические посевы на питательные среды. Этот способ был одним из первых приемов длительного сохранения микроорганизмов в лабораторных условиях и до настоящего времени широко используется в практике микробиологических работ. Аэробные микроорганизмы пересевают чаще всего на поверхности скошенной агаризованной среды, микроаэрофилы – в полужидкую среду, содержащую 0,2-0,3% агара, анаэробы – в толщу плотной среды или в жидкую среду. Культуры пересевают на свежие среды в 2 пробирки (колбы). В дальнейшем из одной пробирки микроорганизмы используют для работы, культуру во второй пробирке оставляют для сохранения и последующего пересева.

Частота пересева на свежую среду  различных микроорганизмов неодинакова и в большей степени определяется их свойствами. Многие микроорганизмы можно пересевать раз в 1-2 месяца, хотя есть микроорганизмы, например молочнокислые бактерии, которые нуждаются в более частых пересевах. Допустимые сроки пересевов некоторых микроорганизмов приведены ниже. Хранение культур в холодильнике при 4-60 позволяет увеличить время между пересевами.

 

                                                                                               

  

 

Поддержание культур микроорганизмов регулярными пересевами имеет ряд существенных недостатков. Основным из них – возможная утрата некоторых морфологических и физиологических признаков. Кроме того, частые пересевы снижают биохимическую активность культур, повышают опасность инфицирования ее посторонними микроорганизмами. При частых пересевах, особенно на жидкие среды, велика вероятность возникновения спонтанных мутантов и их селекция.

Хранение под минеральным маслом. Хранение под минеральным маслом широко используется для бактерий и микроскопических грибов. Это метод обеспечивает довольно длительное сохранение жизнеспособности и стабильности таксономических групп. Масло предотвращает высыхание среды, замедляет процессы метаболизма и позволяет увеличить время между пересевами.

Микроорганизмы выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде; аэробные микроорганизмы – на поверхности коротко скошенной (под углом 450) среды, анаэробы – в толще среды (посев уколом или в расплавленную среду с перемешиванием).  После того как культуры хорошо разовьются, их заливают маслом. Как правило, аспорогенные бактерии заливают через 2-7 суток после посева в зависимости от скорости роста микроорганизма, бациллы и актинонимицеты – в стадии сформировавшихся покоящихся форм. Дрожжи рекомендуется заливать маслом через 4-10 суток, мицелиальные грибы – через 7-12 суток.

Наиболее пригодно для заливки культур микроорганизмов высокоочищенное медицинское вазелиновое масло с плотностью 0,8-0,9. Предварительно масло стерилизуют 1 ч в автоклаве при 1210 (1 ати), а затем для удаления влаги прогревают в течение 1 ч в сушильном шкафу при температуре не выше 1500 или оставляют на двое - трое суток при комнатной температуре. Культуры заливают маслом так, чтобы слой его не превышал 1 см над средой или верхним краем скошенной среды, и сохраняют при комнатной температуре либо в холодильнике при 4-60.

Для пересева клетки из-под масла отбирают петлей и, удалив излишки масла проведением петли по стенке пробирки, переносят на свежую питательную среду. Рекомендуется использовать среду того же  состава, на которой культуру хранили. Многие микроорганизмы в первом пассаже после хранения под маслом развиваются медленнее, однако при последующих пересевах скорость роста их восстанавливается.

Метод хранения микроорганизмов под вазелиновым маслом прост, удобен в обращении, может быть использован в любой лаборатории. К недостаткам его можно отнести возможность инфицирования помещения микроорганизмами за счет разбрызгивания масла при обжигании петли, а также необходимость специальной очистки посуды от масла.

Хранение в лиофилизированном состоянии. Хранение лиофильно-высушенных клеток широко распространенный метод длительного сохранения микроорганизмов. Лиофилизацией называют процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток. Лиофильно-высушенные клетки сохраняют в ампулах, запаянных под вакуумом. Применение этого метода позволяет в течение 10-20 и более лет сохранить  без заметных изменений жизнеспособность, морфологические, культуральные, физиологические свойства, а также биохимическую активность клеток.

Микроорганизмы, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или окончания формирования покоящихся форм. Затем клетки или соответственно покоящиеся формы суспендируют в специальных жидкостях, получивших название защитных сред. В состав защитных сред входят различные вещества, которые предохраняют клетки от повреждений в период замораживания и высушивания. Ниже приведены рецепты защитных сред, используемых для лиофилизации клеток различных микроорганизмов:

 

 

                                
Для успешной лиофилизации плотность в защитной среде должна быть как можно более высокой – 109-1010 клеток в 1 мл. Полученную суспензию разливают в ампулы из нейтрального стекла по 0,5-1,0 мл, замораживают при температуре от -20 до -700, затем высушивают и запаивают под вакуумом. Остаточная влажность лиофизированных клеток колеблется от 1 до 6% и определяется составом защитной среды и режимом высушивания. В различных лабораториях режимы замораживания и высушивания заметно варьируются и во многом зависят от имеющегося оборудования. Ампулы с лиофильно-высушенными клетками рекомендуется сохранять в темноте при температуре 4-60. хранение при более высокой температуре, особенно превышающей 25-300, заметно снижает выживаемость клеток.

Для реактивации к лифилизированным клеткам добавляют по каплям стерильную или водопроводную воду в количестве 0,5-1,0 мл. после регидратации клетки высевают на богатые питательные среды.

Лиофилизацию широко применяют для длительного хранения различных микроорганизмов. Тем не менее этот метод нельзя считать универсальным. Следует отметить, что к лиофилизации более устойчивы грамположительные, чем грамотрицательные бактерии. Очень плохо переносят ее фототрофные и хемолитотрофные бактерии, микоплазмы, многие облигатные анаэробы. Выживаемость спор после лиофилизации заметно выше, чем вегетативных клеток. Дрожжи с мелкими клетками и аскоспорами родов Pichia и  Hansenula выдерживают лифилизацию лучше, чем слабоспорулирующие или неспорулирующие крупные клетки дрожжей родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Rhodotorula.

 Хранение при низких и сверхнизких температурах. Хранение микроорганизмов в замороженном состоянии при низких и сверхнизких температурах по сравнению с другими методами характеризуется наибольшей универсальностью. Однако этот метод требует специального оборудования и большой осторожности в работе с жидким азотом, поэтому используется лишь для сохранения микроорганизмов, не выдерживающих лиофилизацию.

 Клетки  замораживают при разных температурах (от -10 до -1960) и различных скоростях замораживания. Для защиты от повреждающего действия низких температур клетки предварительно суспендируют в растворах криопротекторов. Чаще других применяют 10-20%-ный раствор глицерина, 7-10%-ный раствор диметилсульфоксида или 20%-ный раствор сахарозы. Суспензию клеток с высокой плотностью (109-1010 клеток в 1 мл) разливают в ампулы или флаконы с завинчивающейся крышкой. Ампулы запаивают и помещают в холодильник с температурой -700, а затем переносят в жидкий азот, где и сохраняют при -1960. оттаивание замороженных клеток должно быть как можно более быстрым. Поэтому ампулы погружают на 2 мин в водяную баню с температурой 35-450. клетки из ампул высеиваются на богатые питательные среды.

При температуре хранения от -20 до -400 хорошо выживают немногие микроорганизмы; значительно эффективнее хранение при -700 в твердой углекислте и особенно в условиях сверхнизких температур: при -1960 (жидкий азот) или при -2100 (газовая фаза жидкого азота).

Хранение в глицероле. Одним из самых удобных методов хранения микроорганизмов является их содержание при низких температурах (-200) в растворах глицерола, который служит криопротектором. Данный способ широко распространен, однако не все микроорганизмы выдерживают такую обработку. Поэтому считается, что для клеток, подвергаемых замораживанию в глицероле, необходимы предварительные эксперименты по определению степени выживаемости их. Наибольшее распространение это способ консервации микроорганизмов получил при хранении суспензий различных спор.

Для проведения экспериментов по хранению готовят 50%-ный раствор глицерола в дистиллированной воде и стерилизуют его при 1 ати в течение 30 мин. Клетки из выросшей культуры (обычно из середины экспоненциальной фазы роста), предназначенные для хранения, смешивают в пропорции 1:1 с 50%-ным глицеролом, перемешивают и ставят в морозильник. Хранить суспензии удобно в стерильных пробирках Эппендрофа, а для их приготовления использовать автоматические пипетки со стерильными наконечниками и готовить смеси в ламинарном шкафу. Из сохраняемых клеток периодически (2-6 раз в год) отбирают пробы для проверки на выживаемость. В зависимости от результатов проверки рассчитывают схемы консерваций той или иной культуры и периодичности их пересева.

Для хранения микроорганизмов с твердых сред перед смешиванием с глицеролом готовят суспензии в жидкой среде или в оптимальном для хранения буферном растворе (проверяется экспериментально).

Хранение в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Хранение микроорганизмов в дистиллированной воде или 1%-ном раствре хлорида натрия не требует специального оборудования и доступно любому экспериментатору. Допустимые сроки хранения некоторых микроорганизмов этими методами приведены в таблице 3.

 

Микроорганизмы предварительно выращивают в оптимальных условиях, после чего клетки суспендируют в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Успешному сохранению клеток способствует высокая плотность суспензии – не менее 108-109 клеток в 1 мл. Суспензию разливают в стерильные пробирки или флаконы и сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре. Оставлять на хранение рекомендуется клетки начала стационарной фазы роста культуры или сформировавшиеся покоящиеся формы – споры, цисты.

Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах. Этот метод применяют главным образом для актиномицетов, микроскопических грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. В качестве адсорбентов используют почву, кварцевый песок, силикагель, вату, фильтровальную бумагу. Разработанной стандартной техники это способ не имеет. В самом общем виде он сводится к тому, что стерильный адсорбент, помещенный в ампулы, смешивают с густой суспензией клеток и высушивают под вакуумом или при комнатной температуре. Затем ампулы запаивают и хранят при комнатной температуре или в холодильнике. Имеются данные, что у актиномицетов после хранения в почве или в кварцевом песке восстанавливаются некоторые таксономические признаки (окраска воздушного и субстратного мицелия), которые были утрачены в процессе длительного культивирования в лаборатории.