Производство биоудобрений для сельского хозяйства

Оценка жизнеспособности микроорганизмов после длительного хранения. Жизнеспособность микроорганизмов после различных сроков хранения определяют путем высева их на богатые питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний. Процент выживаемости микроорганизмов определяют по отношению числа сохранившихся клеток к первоначальному числу жизнеспособных клеток (до начала хранения), принятому за 100%. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Методы учета численности  бактерий.

О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т.д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов.

Большинство микроорганизмов, растущих в природных образцах, еще ждут своей очереди быть выделенными в чистые культуры. По некоторым оценкам, можно культивировать меньше 0,1% всего микробного разнообразия.

Десятки тысяч видов микроорганизмов нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относятся к так называемым «некультивируемым» и, таким образом остающимся недоступным классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение.

Культивируемые микроорганизмы обладают способностью к росту на плотных и жидких питательных; а некультивируемые - организмы, которые не прорастают на обычно пригодных для них средах. Эта категория относится к физиологическому состоянию известных организмов, а не организмам, для которых не подобраны методы культивирования.

Поэтому выделяют следующие методы количественного учета для некультивируемых форм:

Определение количества клеток микроорганизмов под микроскопом. Метод позволяет определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых). Основное ограничение метода — необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

1. Подсчет клеток в счетных камерах. Это метод рекомендуется использовать для подсчета некоторых относительно крупных бактерий.

2. Капиллярный метод прямого счета микроорганизмов. Позволяет подсчитывать мелкие микроорганизмы. Применяется для подсчета микробных клеток и контроля роста бактерий.

3. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского—Брида). Этот метод применяется в различных модификациях для определения численности микроорганизмов в разнообразных естественных субстратах. Преимущество метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храниться.

4. Подсчет клеток на мембранных фильтрах.Данный метод рекомендуется использовать для определения численности микроорганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток.

При выявлении и количественном учете микроорганизмов широко применяют люминесцентную микроскопию. Люминесцентная микроскопия дает также возможность выявить и оценить в исследуемой пробе численность отдельных групп микроорганизмов.

Методы количественного учета для культивируемых форм:

Определение числа клеток микроорганизмов высевом на питательные среды. В отличие от подсчета микроорганизмов под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить лишь число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, причем не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут (например, так называемые жизнеспособные, но не культивируемые формы) или растут очень медленно.

1. Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха). Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки.
2. Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений).Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах.
3. Определение биомассы взвешиванием. Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде.
4. Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом. Позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии или культуральной жидкости.Нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений.

Кроме количественного учета микроорганизмов, чрезвычайно важно анализировать качественный состав микробного сообщества, который может указать на роль и потенциал микробоценоза в экосистемах. Существует несколько различных методов анализа структуры микробного сообщества:

1. Структура сообществ на основе липидного анализа. Информация, полученная с помощью липидного анализа, позволяет частично проникнуть внутрь микробного сообщества. ЖК образцы из природных микробных сообществ представляют в основном широкий спектр сложных молекул в которых эти образцы ЖК обеспечивают количественный анализ, но интерпретация отдельных специфических компонентов сообщества может быть трудной. Количественные сравнения суммарных образцов ЖК могут дать информацию о структуре сообщества в целом, но не могут обеспечить более детальный анализ на уровне (внутри) отдельных специфических микробных групп.

Анализ содержания специфических липидных биомаркеров не может определить каждый вид микроорганизмов в природных образцах, т.к. много видов имеют сходный ЖК состав. Некоторые специфические группы микроорганизмов, однако, имеют характерный специфический ЖК профиль.

Липидный анализ может быть чрезвычайно полезен, когда основные физические параметры или экология системы известны. В особенности, ЖК анализ обеспечивает оценку гетерогенности образцов или гетерогенность внутри образца и оценку структуры сообществ. Липидный анализ дает такую информацию о сообществах, которую невозможно получить другими методами.

2. Структура сообществ на основе анализа нуклеиновых кислот. Анализ ДНК в образцах был использован успешно для усиления ЖК анализа.

Такой подход позволяет определить физиологический потенциал микробного сообщества. По сравнению с ЖК анализом это более детальный подход для изучения структуры микробных сообществ, он представляет собой комбинацию следующих методов: амплификацию с помощью ПЦР, следующие затем денатурирующий градиентный гель электрофорез (DGGE) или температурный градиентный гель электрофорез (TGGE) – анализ генов рРНК.

Сочетание ЖК анализа и анализа НК может быть очень полезным для характеристики биомассы и структуры микробного сообщества. Липидный анализ является показателем фенотипических свойствам сообщества, которые показывают существующую в настоящий момент микробиологическую активность, скорость роста, действие токсикантов, несбалансированный рост, дефицит некоторых питательных веществ, метаболический баланс между аэробами и анаэробами, в то время как анализ НК позволяет более детально оценить структуру и физиологический потенциал микробного сообщества.

BIOLOG. Автоматизированная система идентификации микроорганизмов, основанная на аэробной метаболической активности, используется для определения сравнительной структуры микробных сообществ. Система основана на оценке дифференциальной бактериальной метаболической активности в отношении 92 углеродсодержащих субстратов и может показать различия в метаболизме микробных сообществ.

3. Структура сообществ на основе анализа изолированных штаммов. Для идентификации культивируемых микроорганизмов в настоящее время широко используется анализ содержания distinctive ester-linked FA (преимущественно для фосфолипидов и липополисахаридов клинических изолятов). Образцы уникальных (выдающихся ЖК из микроорганизмов, выращенных на стандартной среде используются для дифференцировки более чем 2000 организмов с использованием стандартной системы MIDI идентификации (MIDI, Newark, Del.). Использование этой системы требует предварительной изоляции и культивирования штаммов. Как результат этого, некультивируемые организмы, составляющие значительную часть микробного сообщества не могут быть идентифицированы (Hurst, 2002).

Многие патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, сохраняясь в балластной воде как в культивируемом, так и в некультивируемом состоянии, могут представлять угрозу для водных сообществ акваторий, куда идет сброс балласта.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Производство биоудобрений для сельского хозяйства.

В настоящее время во всем мире наблюдается значительный рост сельскохозяйственной отрасли. Это связано с рядом достаточно разнообразных факторов, среди которых:

- Постепенное истощение природных  ресурсов и энергоносителей (газ, нефть и пр.), а, следовательно, требуются  новые виды сырья, в качестве  которого себя прекрасно зарекомендовало  сырье растительного происхождения - биогаз, биотопливо, спирт на растительной основе.

- Глобальное увлечение человека  здоровым образом жизни, которое, в том числе, подразумевает употребление  в пищу натуральных продуктов, не содержащих консервантов, химических  добавок и т.д.

- В мире наблюдается тенденция  возвращения человека к ведению  натурального хозяйства. Человек  стремится к отдалению от города, самодостаточности и полному  обеспечению себя продуктами  собственного труда.

Одним из наиболее актуальных применений биотехнологии в данной области является производство различных видов бактериальных удобрений, поскольку микрофлора почвы оказывает непосредственное влияние на её плодородие и, как следствие, на урожайность растений. Почвенные микроорганизмы в процессе роста улучшают структуру почвы, накапливают в ней питательные вещества, минерализуют различные органические соединения, превращая их в легко усвояемые растением компоненты питания. Для стимуляции этих процессов применяют различные бактериальные удобрения, обогащающие ризосферу растений полезными микроорганизмами. Микроорганизмы, используемые для производства бактериальных препаратов, способствуют снабжению растений не только элементами минерального питания, но и физиологически активными веществами (фитогормонами, витаминами и др.). В настоящее время наибольшее распространение в сельском хозяйстве получили такие бактериальные удобрения, как нитрагин, ризоторфин, азотобактерин, фосфобактерин. Их практическая применимость и существенная эффективность не оставляют сомнений, что подтверждается многочисленными научными исследованиями, например работой группы ученых МСХА им. Тимирязева под руководством А.Н. Постникова, исследовавших влияние биологических препаратов на рост и урожайность картофеля в средней полосе России. Выводы, сделаные этой группой, приведены в заключительной части данной работы. К настоящему моменту доказано, что применение бактериальных удобрений не только способствует повышению урожайности ценных культур, но и значительно снижает нагрузку на окружающую среду со стороны химических соединений -- минеральных удобрений и средств защиты растений, что позволяет более эффективно использовать ограниченные земельные ресурсы, затрачивать меньше усилий на их восстановление.

Технология изготовления бактериальных удобрений является достаточно простой с точки зрения биотехнологии и с точки зрения аппаратного оснащения процесса, что также повышает ее экономическую ценность. В следующей главе будут подробно рассмотрены процессы изготовления наиболее распространенных и широко используемых биопрепаратов.

 Производство бактериальных удобрений

 Производство нитрагина  и ризоторфина

Отечественная промышленность выпускает два вида препаратов клубеньковых бактерий: нитрагин и ризоторфин. Оба препарата производятся на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. Эти бактерии в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением.

Бактерии рода Rhizobium - строгие аэробы. Среди них различают активные, малоактивные и неактивные культуры. Критерием активности клубеньковых бактерий служит их способность в симбиозе с бобовым растением фиксировать атмосферный азот и использовать его в виде соединений для корневого питания растений.

Фиксация атмосферного азота возможна только в клубеньках, образующихся на корнях растений. Возникают они при инфицировании корневой системы бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой системы происходит через молодые корневые волоски. После внедрения бактерии прорастают внутри них до самого основания в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и распределяются по клетками коры. При этом индуцируется деление клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации бактерий на корне растения-хозяина образуются клубеньки, в которых бактерии быстро размножаются и располагаются по отдельности или группами в цитоплазме растительных клеток. Сами бактериальные клетки увеличиваются в несколько раз и меняют окраску. Если клубеньки имеют красноватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента легоглобина (леггемоглобина) - аналог гемоглобина крови животных, то они способны фиксировать молекулярный азот. Неокрашенные ("пустые") или имеющие зеленоватую окраску клубеньки не фиксируют азот.

Бактерии, находящиеся в клубеньках, синтезируют ферментную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливающую молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака происходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных превращений, приводящих к образованию глутамина и глутаминовой кислоты, идущих в дальнейшем на биосинтез белка.

Помимо критерия активности в характеристике клубеньковых бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует способность микроорганизма вступать в симбиоз с бобовым растением, то есть проникать через корневые волоски внутрь корня и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость такого проникновения. В симбиотическом комплексе растение - Rhizobium бактерии обеспечиваются питательными веществами, а сами снабжают растение азотистым питанием. С вирулентностью связана и видовая избирательность, которая характеризует способность данного вида бактерий к симбиозу с определенным видом бобового растения. Классификация различных видов Rhizobium учитывает растение-хозяина, например: Rhizobium phaseoli - для фасоли, Rhizobium lupini - для люпина, сараделлы и т.д. Вирулентность и видоспецифичность взаимосвязаны и не являются постоянными свойствами штамма.