Санитарно-микробиологическое значение и методика выявления при ветеринарно-санитарной экспертизе пищевых продуктов микроорганизмов

Контроль  продовольственного сырья и пищевых  продуктов по содержанию в них  остаточных количеств пестицидов и  агрохимикатов, в том числе фумигантов, основывается на информации, представляемой изготовителем (поставщиком) продукции  об использованных при ее производстве и хранении пестицидах и агрохимикатах.

Контроль  содержания стимуляторов роста животных (в том числе гормональных препаратов), лекарственных средств (в том  числе антибиотиков), применяемых  в животноводстве для целей откорма, лечения и профилактики заболеваний  скота и птицы, препаратов, основывается на информации, представляемой изготовителем (поставщиком) продукции об использованных при ее изготовлении и хранении стимуляторов роста животных и лекарственных  препаратов.

Полихлорированные бифенилы контролируются в рыбе и  рыбопродуктах; бенз(а)пирен - в зерне, в копченых мясных и рыбных продуктах.

В жировых продуктах контролируются показатели окислительной порчи: кислотное  число и перекисное число. ²¹

В пищевых продуктах не допускается  наличие патогенных микроорганизмов  и возбудителей паразитарных заболеваний, их токсинов, вызывающих инфекционные и паразитарные болезни или представляющих опасность для здоровья человека и животных.

Гигиенические нормативы по микробиологическим показателям  безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов включают следующие  группы микроорганизмов:

- санитарно-показательные, к которым  относятся: количество мезофильных  аэробных и факультативно-анаэробных  микроорганизмов (КМАФАнМ), бактерии  группы кишечных палочек - БГКП (колиформы), бактерии семейства  Enterobacteriaceae, энтерококки; 

- условно-патогенные микроорганизмы, к которым относятся: Е. coli, S. aureus, бактерии рода Proteus, В. cereus и сульфитредуцирующие  клостридии, Vibrio parahaemolyticus и другие;

- патогенные микроорганизмы, в т.ч.  сальмонеллы и Listeria monocytogenes, бактерии рода Yersinia.

Нормирование  микробиологических показателей безопасности пищевых продуктов осуществляется для большинства групп микроорганизмов  по альтернативному принципу, т.е. нормируется  масса продукта, в которой не допускаются  бактерии группы кишечных палочек, большинство  условно-патогенных микроорганизмов, а также патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы и Listeria monocytogenes. В других случаях норматив отражает количество колониеобразующих единиц в 1 г (мл) продукта (КОЕ/г, мл).

Критериями  безопасности консервированных пищевых  продуктов (промышленная стерильность) является отсутствие в консервированном продукте микроорганизмов, способных  развиваться при температуре  хранения, установленной для конкретного  вида консервов, и микроорганизмов  и микробных токсинов, опасных для здоровья человека.

Продукты  детского питания должны соответствовать  функциональному состоянию организма  ребенка с учетом его возраста и быть безопасными для здоровья ребенка.

Продукты  детского питания и их компоненты, продукты для беременных и кормящих женщин (далее - специализированные продукты) должны соответствовать гигиеническим  нормативам безопасности и пищевой  ценности, установленным Санитарными правилами.

 

2. Собственные  исследования.

2.1. Отбор и подготовка  пробы продукта

 

Отбор проб пищевых продуктов  для санитарно-бактериологического  исследования проводится в соответствии с существующими ГОСТ. Молоко и  молочные продукты из тары большой  емкости отбирают в количестве не менее 0,25 л в стерильные колбы. ²²

Отобранные пробы мяса и рыбы упаковывают в стерильный пергамент, а затем в оберточную бумагу. Мясные и рыбные полуфабрикаты  берут в количестве 1 — 2 штук в  стерильные банки. Холодные закуски, первые и вторые горячие блюда, пробы  кондитерских изделий с кремом отбирают по 1 порции в стерильную посуду. Отобранные пробы пломбируют и по возможности быстрее доставляют в лабораторию. Из отобранных проб в лаборатории берут навеску в 25—30 г. Навеску из плотных продуктов измельчают с небольшим количеством 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия в гомогенизаторе или растирают со стерильным кварцевым песком в стерильной ступке. Полученную взвесь отстаивают и надосадочную жидкость используют для дальнейших исследований. Жидкие и полужидкие продукты тщательно размешивают. Продукты с резко кислой реакцией подщелачивают 10% раствором гидрокарбоната натрия до нейтральной реакции (рН — 7,0— 7,2), Сливочное масло, кремы, мороженое и подобные им продукты расплавляют при температуре 40—43°С. Из подготовленных образцов продуктов готовят ряд последовательных 10-кратных разведений, которые используют для дальнейших исследований.²³

 

 

2.2.  Характеристика  среды (сред) накопления и методика  посева

 

Определение общего микробного обсеменения проводят путем посева в стерильные чашки Петри по 1 мл определенных разведений продукта (1:10,    1:100 и т. д.). Под общим микробным обсеменением подразумевается количество аэробов и факультативных анаэробов, дающих рост на мясо-пептонном агаре при 37°С в перерасчете на 1 г или 1 мл продукта.

Определение БГКП. Посевы различных  разведений продукта производят на модифицированную среду Кесслера или Хейфеца. Среда Кесслера разлита по пробиркам с поплавками, содержит глюкозу и генциановый фиолетовый, который задерживает рост молочно-кислых бактерий. В состав среды Хейфеца входят маннит и индикатор, изменяющий цвет среды при расщеплении маннита. При росте кишечной палочки на среде Кесслер в поплавке образуется газ, и она мутнеет; среда Хейфеца изменяет цвет. Пробы молочных продуктов, кондитерских изделий, салатов, рыбы засевают на среду Кесслер, мясо и мясные продукты — на среду Хейфеца. Посевы инкубируют в термостате при 43°С в течение 18—20 ч. При наличии характерного роста на указанных средах производят пересев на среду Эндо. На среде инкубируют посевы в термостате при 37°С в течение 24 ч, после чего микроскопируют выросшие колонии. Обнаружение грамотрицательных палочек, дающих помутнение и газообразование в среде Кесслер, изменение цвета среды Хейфеца свидетельствуют о наличии в исследуемом разведении БГКП. Титр кишечной палочки определяют по соответствующим таблицам на основании посевов 10-кратных разведений.

 

2.3. Характеристика  плотной элективной среды (сред) и методика посева

Питательная среда "Клебсиелла 5-АСК 20" предназначена для одноэтапного выделения и одновременной идентификации  бактерий рода Klebsiella (виды К. pneumoniae, K. oxytoca, K. mobilis) в течение 18 - 24 ч.²⁴

При количественном посеве материала возможен количественный учет бактерий рода Klebsiella в материале.

Набор питательной среды "Клебсиелла 5-АСК 20" рассчитан  на проведение 80 анализов.

Метод питательной среды "Клебсиелла 5-АСК 20" основан на выявлении 5-аминосалицилатдекарбоксилазы - уникального фермента бактерий рода Klebsiella. Этот фермент расщепляет 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) с образованием пара-аминофенола, который под действием кислорода  воздуха образует полимер черно-коричневого  цвета. В результате этой хромогенной  реакции вокруг колоний клебсиелл  образуется широкая зона черно-коричневой окраски среды. Ввиду уникальности этого признака идентификация условно  патогенных для человека клебсиелл (К. pneumoniae, K. oxytoca, K. mobilis) проводится одновременно с их выделением на данной среде  первичного посева материала. Непатогенные для человека виды клебсиелл (K. terrigena, K. planticola) не дают хромогенную реакцию.

Состав набора питательной среды "Клебсиелла 5-АСК 20": сухой питательный агар из рыбного гидролизата, 14 г - 1 пакет, 5-аминосалициловая кислота, 2 г - 1 уп, L-арабиноза, 4 г - 1 уп., спиртовой раствор бромтимолового синего, 1,6 мл - 1 пр., натрия гидроокись, 15 мл - 1 фл.

Навеску сухого питательного агара из рыбного гидролизата  растворяют по прописи на пакете (14 г на 400 мл дистиллированной воды), фильтруют  через марлевый фильтр и стерилизуют  в паровом стерилизаторе при  температуре 120 °С в течение 30 мин. В  стерильную колбу вносят 2 г 5-аминосалициловой кислоты, 4 г L-арабинозы, 400 мл горячего расплавленного питательного агара, 1.6 мл спиртового раствора бромтимолового синего. Перемешивают. Добавляют около 12 мл 1 N раствора натрия гидроксида до установления рН=7.0 (до зеленой окраски  среды), разливают среду в стерильные чашки Петри по 20 мл. Среда должна быть прозрачной, зеленого цвета.

Чашки с питательной средой "Клебсиелла 5-АСК 20" хранить при  температуре 4 - 8 °С до 5 суток.

Исследуемый материал (отделяемое ран, моча, фекалии, разведения фекалий  при исследовании на дисбактериоз, смывы с объектов санитарного  контроля и др.) засевают петлей или  ватным тампоном на поверхность среды (возможен посев на 1/4 часть чашки  Петри), инкубируют при 35 - 37 °С в течение 20 - 24 ч, после чего идентифицируют бактерии рода Klebsiella по наличию зон темно-коричневой окраски среды вокруг выросших колоний. При необходимости можно осуществлять количественный посев материала  и количественный учет колоний. Среду  можно также использовать для  идентификации чистых культур бактерий по хромогенной реакции с 5-АСК.

Основные характеристики питательной среды "Клебсиелла 5-АСК 20": чувствительность (ростовая): 2 - 10 КОЕ бактерий К. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. oxytoca, K. mobilis; 105 КОЕ бактерий К. pneumoniae subsp. ozaenae и subsp. rhinoscleromatis. Специфичность: 100 % - отсутствие хромогенной реакции у клинических изолятов прочих родов бактерий. Скорость роста бактерий рода Klebsiella - 20 - 24 ч. Диагностическая значимость: выделение и сопряженная идентификация бактерий рода Klebsiella (видов К. pneumoniae, K. oxytoca, K. mobilis) в 92.2 ± 2.7 % проб. Идентификация чистых культур К. pneumoniae subsp. ozaenae и subsp. rhinoscleromatis - 100 % штаммов. Объем исследований - 20 чашек среды. ²⁵

Условия хранения и транспортировки питательной  среды "Клебсиелла 5-АСК 20". Набор питательной среды "Клебсиелла 5-АСК 20" хранить при температуре не выше 22 °С. Транспортировку питательной среды для "Псевдомонас АПС-20" осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре не выше 30 °С не более 2 недель.

 

2.4. Учет роста  на плотной элективной среде.  Характеристика колоний

Таблица 1. Сравнительная  характеристика дифференцирующих свойств  предлагаемой среды и известной, взятой за прототип.

Тест - штаммы	Известная среда	Предлагаемая среда
Инозит	Цвет колоний	5-аминосалициловая кислота	Цвет колоний
1. K. pneumoniae 3534/51	+	желтый	+	Коричневый преципитат
2. K. oxytoca	+	желтый	+	Коричневый преципитат
3. K. mobilis	+	желтый	+	Коричневый преципитат
4. S. marcescens 1	+	желтый	-	желтый
5. P. rettgori	+	желтый	-	желтый
6. Y. enterocolitica	+	желтый	-	желтый
7. E.coli Su 3912/41 O55 K:59	-	синий	-	желтый
8. E. cloacae 10005	-	синий	-	желтый
9. С. freundii 101/57	-	синий	-	желтый

 

Хромогенная питательная  среда для выявления и идентификации  клебсиелл, содержащая источник азота, 5-аминосалициловую кислоту, бромтимоловый  синий, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно  содержит глюкозу, парааминобензойную кислоту, экстракт кормовых дрожжей, трис-буфер, натрий углекислый, бриллиантовый зеленый, а в качестве источника азота - сухой питательный агар при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

питательный агар, сухой	35,0-40
глюкоза	5,0-6,0
5-аминосалициловая кислота	2,0-3,0
экстракт кормовых дрожжей	3,0-5,0
парааминобензойная кислота	0,01-0,02
бромтимоловый синий	0,08-0,09
трис-буфер	1,0-1,5
натрий углекислый	0,6-0,7
бриллиантовый зеленый	0,0001-0,0002
агар микробиологический	2,5-3,0

 

Рис. 2. Колония микроорганизмов

 

 

2.5. Характеристика  тестов, необходимых для дифференциации  и идентификации данных микроорганизмов

 

Таблица 2. Тесты дифференциации лактозопозитивных, не образующих сероводород энтеробактерий.

Род	подвижность	ацетоин	мочевина	цитрат Симмонса	индол	инозит	малонат
Escherichia Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia	Х + - +   +	- - + +   +	- чаще - + чаще-   чаще-	- + + +   +	+,- Х -,+ -   -	-,+ - +,- чаще+   Х	- Х + чаще+   -

Опорные тесты: лизин(-), фенилаланиновый (триптофандезаминазный) тест (-), продукция  ацетоина (-), рост в среде с цианидом калия (+), подвижность (+).

Род Proteus дифференцируют от бактерий трибы сальмонелл и эдвардсиелл (сероводородопозитивные виды), а также от провиденций (сероводородонегативные виды). Опорные тесты: мочевина (+), лизин (-), арабиноза (-), фенилаланиновый тест (+). При внутривидовой дифференциации сероводородопозитивных протеев учитывают, что мирабильный протей,в отличие от вульгарного, не продуцирует индол, не расщепляет мальтозу и ферментирует орнитин. При дифференциации сероводородонегативных протеев (P.myxofaciens) принимают во внимание, что они в отличие от P.rettgeri не расщепляют маннит и отрицательны по индольному тесту, а от Morganella - дифференцируются положительным цитратным тестом в среде Симмонса, отсутствием декарбоксилазы орнитина и индолообразования.

Providencia дифференцируют от шигелл и сероводороднегативных протеев. Опорные тесты: фенилаланиновый (+), цитратный Симмонса (+), мочевина (-), орнитин (-), маннит (+ -).

Klebsiella дифференцируют от эшерихий, гафний, серраций, энтеробактеров. Опорные тесты: инозит (+), лизин (+), орнитин (-), аргинин (-), глицерин (+), отсутствие подвижности.