Ферменты

ЛДГ-4 (H1M3) и ЛДГ-5 (М4) находятся в тканях, склонных к анаэробному обмену (печень, скелетные мышцы, кожа, мозговой слой почек), обладают низким сродством к лактату и катализируют превращение пирувата в лактат.

В тканях с промежуточным типом обмена (селезенка, поджелудочная железа, надпочечники, лимфатические узлы) преобладает ЛДГ-3 (H2M2).

C медицинской точки зрения появление в плазме крови изоферментов характерных для определённой ткани говорит о поражении клеток этого органа. Например, ЛДГ-1, ЛДГ-2 и КК-2 появляются при инфаркте миокарда, ЛДГ-5, ЛДГ-4 при травмах мышечной ткани.

Мультиферментные комплексы

В мультиферментном комплексе несколько ферментов прочно связаны между собой в единый комплекс и осуществляют ряд последовательных реакций, в которых продукт реакции непосредственно передается на следующий фермент и является только его субстратом. Благодаря таким комплексам значительно ускоряется скорость превращения молекул.

Строение мульферментного комплекса

Например,

• пируватдегидрогеназный комплекс (пируватдегидрогеназа), превращающий пируват в ацетил-КоА, (в клетках человека состоит из ~ 330 полипептидных цепей);
• α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс (в цикле трикарбоновых кислот) превращающий α-кетоглутарат в сукцинил-КоА;
• комплекс под названием "синтаза жирных кислот" (или пальмитатсинтаза), обеспечивающий синтез жирных кислот.

 

 

4. Что мы понимаем под "активностью фермента"?

Прежде чем обсуждать свойства ферментов и зависимость ферментов от каких-либо факторов необходимо определиться с понятием активность ферментов.

В повседневной биохимической практике обычно не оценивается  количество фермента, а только его активность. Активность – более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции, а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом следует учитывать время, которое затрачивает фермент на преобразование и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу). 

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три меняющихся фактора:

• масса полученного продукта или истраченного субстрата,
• время, потраченное на реакцию,
• количество биологического материала, содержащего фермент.

Единицы измерения активности и количества фермента.

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала, содержащего фермент.

В практике обычно используют:

• единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
• единицы времени – минута, час, секунда,
• единицы массы или объема – грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные – катал (моль/сек), международная единица активности - МЕ, (IU, International Unit) соответствует мкмоль/мин.

Взаиморасчёт этих величин выглядит следующим образом:

1 катал = 1 моль/сек = 60 моль/мин = 60х106 мкмоль/мин = 6х107 ME

1ME = 1 мкмоль/мин = 1/60 мкмоль/сек = 1/60 мккатал = 16, 67 нкат

 

Удельная активность фермента численно ровна количеству единиц активности фермента в биологическом образце (МЕ), делённому на массу (мг) белка в этой ткани. Обычно используется для оценки очистки фермента.

 

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.

Например, известно,

• что 1 г пепсина расщепляет 50 кг яичного белка за один час – таким образом, его активность составит 50 кг/час на 1 г фермента,
• если 1,6 мл слюны расщепляет 175 кг крахмала в час – активность α-амилазы слюны составит 109,4 кг крахмала в час на 1 мл слюны или 1,82 кг/мин×г или 30,3 г крахмала/ с×мл.

При определении активности ферментов необходимо создание стандартных условий, чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура, например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом. Кроме того необходимо при этом наличие избытка субстрата, чтобы работали все имеющиеся в растворе молекулы фермента.

 

5. От  чего зависит активность ферментов?

1. Зависимость скорости реакции  от температуры

Зависимость активности ферментов (скорости реакции) от температуры описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной температуры для данного фермента.

Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до температур денатурации белков. Наряду с этим, как исключение, имеются ферменты некоторых микроорганизмов, существующих в воде горячих источников и гейзеров. Это свойство ферментов используется медицинской лабораторной практике при анализе ДНК.

При понижении температуры активность ферментов понижается, но не исчезает совсем. Иллюстрацией может служить зимняя спячка некоторых животных (суслики, ежи), температура тела которых понижается до 3-5°С. Это свойство ферментов также используется в хирургической практике при проведении операций на грудной полости, когда тело больного или орган подвергают охлаждению до 22°С.

Зависимость скорости реакции от температуры

 

2. Зависимость скорости реакции  от рН

Зависимость также описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при оптимальном для данного фермента значении рН.

Для каждого фермента существует определенный узкий интервал рН среды, который является оптимальным для проявления его высшей активности. Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5, трипсина 8,0-8,5, амилазы слюны 7,2, аргиназы 9,7, кислой фосфатазы 4,5-5,0, сукцинатдегидрогеназы 9,0.

Зависимость скорости реакции от величины pH

Оптимальные значения рН для некоторых ферментов

3. Зависимость от концентрации  фермента

При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.

4. Зависимость скорости реакции  от концентрации субстрата

При увеличении концентрации субстрата скорость реакции сначала возрастает соответственно подключению к реакции новых молекул фермента, затем наблюдается эффект насыщения, когда все молекулы фермента взаимодействуют с молекулами субстрата. При дальнейшем увеличении концентрации субстрата между его молекулами возникает конкуренция за активный центр фермента и скорость реакции снижается.

Зависимость скорости реакции  от концентрации субстрата

Зависимость скорости реакции  от концентрации фермента

 

 

5. Кинетика ферментативных реакций.

Уравнение Михаэ́лиса — Ме́нтен — основное уравнение ферментативной кинетики, описывает зависимость скорости реакции, катализируемой ферментом, от концентрации субстрата.

 

Maud Menten 1879 - 1960

Leonor Michaelis 1875 - 1949

 

В 1903, французский биофизик Victor Henri обнаружил, что ферментативная реакция инициируется после связывания фермента и субстрата. Эта работа была взята за основу немецким биохимиком Михаэлисом (Leonor Michaelis) и канадским физиологом Ментен (Maud Menten) (кстати, первая женщина, получившая докторскую степень по медицине), которые изучали кинетику механизма ферментативной реакции инвертазы при гидролизе сахарозы на фруктозу и глюкозу. В  1913 ими была предложена математическую модель  ферментативной реакции. Они основывались на том, что субстрат [S] взаимодействует с ферментом [E] с образованием фермент-субстратного комплекса [ES] который после преобразования распадается на продукт [P] и фермент. Понятие константы Михаэлиса было внесено в 1925 году английским ботаником Бригсом (G. E. Briggs) и британским генетиком Холдейном (J. B. S. Haldane), так как в модели Михаэлиса-Ментен не учитывалась константа скорости распада [ES] с образованием продукта. В настоящее время математическая модель реакции выглядит следующим образом:

где k1, k-1 и k2 обозначены как констатны скорости. Авторы считали, что образование и распад фермент-субстратного комплекса вполне обратимый процесс. Скорость ферментативной реакции определяется скоростью распада фермент-субстратного комплекса:

V0 = k2[ES]

Практическим путём определить экспериментально уровень [ES] весьма затруднительно, поэтому необходимо было найти альтернативный способ его определения. Для этого были применены некоторые вводные:

• [Et] – общий уровень фермента участвующий в реакции на данный момент (сумма свободного и связанного с субстратом фермента). Тогда концентрация свободного фермента ровна [Et] - [ES].

• так как [S] обычно значительно превосходит концентрацию фермента [Et], можно пренебречь количеством субстрата связанного с ферментом в каждый данный момент реакции.

 

Расчёт имеет несколько этапов:

1 этап. Скорость образования фермент-субстратного комплекса можно представить используя константы скорости синтеза (k1) и распада (k-1 и k2) фермент-субстратного комплекса:

 

(Образование)    ES = k1([Et] - [ES])[S]

 

(Распад)            ES = k-1[ES] + k2[ES]

 

2 этап. Начальные этап каталитической реакции характерен наличием постоянной концентрации  фермент-субстратного комплекса [ES] (распад равен синтезу) т.е. состояния равновесия. Следовательно можно объединить два предыдущих уровнения: 

 

k1([Et] - [ES])[S] = k-1[ES] + k2[ES]           

 

3 этап. Необходимо провести алгеброические преобразования – разделить обе части уравнения на [ES], получится:

 

k1[Et][S] - k1[ES][S] = (k-1 + k2)[ES]     

Перенесём k1[ES][S] в левую часть уравнения и вынесем за скобки [ES], получим:

 

 

k1[Et][S] = (k1[S] + k-1 + k2)[ES]              

 

Решим уравнение, определив [ES]:

 

 

 

Упростим уравнение разделив числитель и знаменатель на k1:

 

Полученное соотношение суммы констант скорости распада к константе скорости синтеза  [ES] –  (k2 + k-1)/k1 получило название константа Михаэлиса (Km).

 

 

 

Этап 4. Полученный результат вносим в уравнение определения скорости ферментативной реакции:

 

 

 

Если принять во внимание, что максимальная скорость реакции Vmax возможна при условии полного насыщения фермента субстратом, т.е [ES] = [Et], то Vmax может быть представлена как k2[Et]. Подставив это в уравнение получаем уравнение Михаэлиса-Ментен как оно выглядит в наши дни:

 

 

 

 

В классическом виде вместо Km стоял коэффициент диссоциации Kd (Kd= k-1/k1) так как авторы основывались на уравнении: k1[E][S] = k-1[ES]. А Лайнвивер и Бэрк внесли новое усовершенствование в уравнение -  k1[E][S] = k-1[ES] + k2[ES]

 

График зависимости скорости ферментативной реакции

от концентрации субстрата.

 

В случае, если скорость ферментативной реакции ровна половине максимальной (на графике), уравнени можно преобразовать:

если 

уравнение приобретает вид:

Разделив обе половины уравнения на Vmax получаем:

 

Решая его относительно Km  получаем:

Km + [S] = 2[S]              или

 

Km = [S]

Константа Михаэлиса - это концентрации субстрата при которой скорость ферментативной реакции ровна половине максимальной.

Определение константы Михаэлиса позволяет говорить о сродстве (связывании) фермента и субстрата: чем ниже Km, тем выше сродство и наоборот.

В практической энзимологии применяется уравнение Михаэлиса-Ментен в преобразовании Лайнвивер-Бэрка (Lineweaver-Burk). Для точных расчётов кривая уравнения Михаэлиса-Ментен не годится. Но если обе половины уровнения преобразовать следующим образом:

и упростить:

то в конечном результате получим уравнение Лайнвивер-Бэрка:

График зависимости обратных величин скорости ферментативной реакции (1/V0) и концентрации субстрата (1/[S]) выглядит следующим образом:

Использование уравнение Лайнвивер-Бэрка позволяет получать более точные результаты, и даже выяснять характер ферментативной реакции и типы ингибирования.