Разработка методик качественного и количественного анализа действующих веществ экстракта плодов аронии черноплодной

 

 

 

 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Фармацевтический факультет

 

Кафедра фармацевтической химии

 

 

 

Крюкова Евгения Андреевна

 

Разработка методик качественного и количественного анализа действующих веществ экстракта плодов аронии черноплодной

Курсовая работа

 

 

 

Студентка IV курса

Фармацевтического факультета

Крюкова Е.А.

 

Руководитель,

Доцент кафедры фармацевтической химии,

Кандидат фармацевтических наук

Кадырова Т.В.

Томск – 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3

Глава 1. Обзор литературы

1. Плоды рябины черноплодной. Характеристика ЛРС, применение в медицине_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 4-5
2. Физико-химические свойства антоцианов, применение_ _ _ _ 6-8

Глава 2. Материалы и методы исследования_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _9-10

Глава 3. Обсуждение результатов

          3.1. Получение водно-спиртового экстракта_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 11-12

          3.2. Качественный анализ_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 13-19

          3.3. Количественный анализ_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _20-22

          3.4. Фракционирование органическими растворителями_ _ _ _ _ _ _ _ 23

Выводы_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 24

Список литературы_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 25

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

Плоды аронии черноплодной (Aronia melanocarpa) применяются в Российской Федерации в качестве поливитаминного средства. Основной нормативный документ на данный вид сырья — фармакопейная статья ФС 42-66-87. Необходимость пересмотра устаревших методик определения качественного и количественного состава очевидна. Это позволит не только повысить качество продукции, но и заметно упростить анализ данного сырья. К тому же данная статья предусматривает анализ только свежего сырья. Методики определения качества сухих плодов вообще не приводится.

Для более детального изучения биохимического состава плодов аронии предполагается использовать метод фракционирования, основанный на различной растворимости каждой из групп биологически активных соединений в определённых органических растворителях.

В соответствии с современными методологическими подходами лекарственное растительное сырье целесообразно анализировать по ведущей группе биологически активных веществ (БАВ), что продиктовано наибольшей ее уязвимостью к технологическим стадиям заготовки и хранения сырья, а также производства препаратов на его основе. Ведущей группой БАВ плодов аронии черноплодной являются антоцианы, однако в ней присутствует и целый комплекс других не менее полезных и активных соединений, которые ещё не совсем изучены.

Таким образом, целью данной работы является: изучение качественного и количественного состава БАВ в экстракте плодов аронии черноплодной.

Задачи:

1. Провести анализ литературных данных.
2. Получение водно-спиртового экстракта из плодов аронии.
3. Провести качественный и количественный анализ полученного экстракта.
4. Разделение на фракции экстракта плодов аронии, с использованием органических растворителей.

 

 

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Плоды рябины черноплодной. Характеристика ЛРС, применение в медицине

 Арония (рябина) черноплодная - Aronia melanocarpa, относящаяся к семейству розоцветные – Rosaceae, представляет собой Листопадный кустарник высотой до 3 м. Продуктивный возраст ветвей не более 10 лет. Восстановление куста происходит за счет ежегодно образующихся порослевых побегов и корневых отпрысков. Однолетние побеги красно-бурые, побеги старшего возраста темно-серые. Корневая система мощная, поверхностная, мочковатая, состоит из вертикально и горизонтально расположенных корней.

Листья очередные, широкоовальные или обратно-яйцевидные, длиной 4-8 см и шириной 3-5 см, простые, цельные, летом ярко-зеленые, осенью красные; верхняя сторона листьев кожистая, глянцевая, гладкая, темно-зеленая, нижняя - слабоопушенная с беловато-матовым оттенком.

Цветки собраны по 12-35 шт. в плотных щитовидных соцветиях; лепестки белые или чуть розоватые. Цветет арония в мае-июне, примерно через 2 недели после распускания листьев, цветение продолжается 12-15 дней. Позднее цветение аронии исключает возможность повреждения цветков весенними заморозками, что обеспечивает ежегодное плодоношение этого растения. Арония - самоопыляемое растение.

Плоды шаровидные или чуть вытянутые, яблокообразные, до 1,5 см в диаметре, голые, черные, блестящие, иногда с сизым налетом, реже темно-красные, сочные, кисловато-сладкие с вяжущим привкусом. Плоды созревают в августе-сентябре, не осыпаются до заморозков.

Родиной этого растения является Северная Америка, в России широко культивируется, благодаря своей неприхотливости и зимостойкости интродуцирована почти во всех экологогеографических районах нашей страны, даже в тех, где затруднено возделывание других плодово-ягодных культур [1].

В свежих плодах содержатся гликозиды цианидина, флаваноновый гликозид гесперидин, флавоноловый рутин, свободный кверцетин и некоторые другие флавоноиды. Присутствуют катехины и дубильные вещества, аскорбиновая кислота (около 110 мг/100 г), витамины B1, B6, Е, РР, органические кислоты (0,8%), микроэлементы (соли молибдена, марганца, меди, бора), каротиноиды и до 10% сахаров (глюкоза, фруктоза, сахароза). Основной химической группой считают антоцины. Антоцианы аронии черноплодной представлены цианидином (рис.1) и его гликозидированными формами — цнанидин-3-гликозидом, цианидин-3-5-диглюкозидом, цианидин-3-галактозидом. Из лейкоантоцианов в плодах находится главным образом лейкоцианидин [5].

Свежие плоды назначают для профилактики Р-витаминной недостаточности, лечения гипертонической болезни I и II стадии и других заболеваний, сопровождающихся повышением артериального давления. Принимают по 100 г 3 раза в день; курс лечения 10-30 дней. Сок аронии черноплодной применяют в начальной стадии гипертонической болезни, при кровотечениях различного происхождения, при атеросклерозе, анацидных гастритах. Плоды аронии принимают при гепатитах, аллергиях, отравлениях. Плоды противопоказаны больным с повышенной свертываемостью крови, а также при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и гиперацидном состоянии желудка.

Лечебные свойства плодов аронии сохраняются и при их переработке. Выявлено, что в 3 столовых ложках (50 г сухих плодов) черноплодной рябины заключено столько витамина Р, которое обеспечивает его суточную дозу при этом авитаминозе. Вяжущий вкус черноплодки напоминает о том, что она содержит много дубильных веществ, органических кислот и пектинов, а значит, прекрасно влияет на пищеварение [4]. 

Так как черноплодная рябина содержит большое количество органических кислот, при гиперацидном гастрите и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки ее употребляют умеренно и только вне обострений. Также употребление плодов и сока лекарственной черноплодной рябины противопоказано при язве 12-перстной кишки, язвенной болезни желудка, при пониженном давлении, тромбофлебитах, частых запорах, пациентам с повышенной свертываемостью крови [9]. 

 

 

2. Физико-химические свойства антоцианов, применение

Антоцианами называют группы растительных пигментов, обусловливающих окраску цветов, а также плодов и ягод. Они широко распространены в растительном мире. Однако среди плодовых и ягодных растений мало культур, которые характеризовались бы таким высоким содержанием антоциановых пигментов, как арония черноплодная.

Строение антоцианов установлено в 1913 году немецким биохимиком Р. Вильштеттером, первый химический синтез осуществлен в 1928 английским химиком Р. Робинсоном.

Общая формула антоцианов представлена на рисунке 2:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Антоцианы являются гликозидами, содержащими в качестве агликона-антоцианидина гидрокси- и метоксизамещённые соли флавилия (2-фенилхроменилия), у некоторых антоцианов гидроксильные группы ацетилированы. Углеводная часть связана с агликоном обычно в положении 3, у некоторых антоцианов - в положениях 3 и 5, при этом в роли углеводного остатка могут выступать как моносахариды глюкоза, рамноза, галактоза, так и ди- и трисахариды.

Антоцианы представляют собой окрашенные кристаллы, легко растворимые в воде и других полярных растворителях, трудно растворимы - в спирте, бензоле. При нагревании с разбавленными  кислотами или при действии некоторых ферментов, отщепляется остаток углевода с образованием пирилиевых солей, которыми обусловлено разнообразие окрасок плодов и цветков растений. Соли щелочных металлов также имеют окраску. В нейтральной среде антоцианы находятся в виде хиноидной структуры. Свободные основания антоцианов и антоцианидов окрашены в фиолетовый цвет. Таким образом, красная, синяя и фиолетовая окраска некоторых цветов и ягод может вызываться наличием одного и того же типа антоцианидина в зависимости от реакции клеточного сока. В синих частях растений он находится в виде калиевой или иной щелочной соли, в красных – в виде оксониевых солей органической кислоты (например, щавелевой кислоты), а в фиолетовой – в виде основания красящего вещества или внутренней соли.

В силу высокой электрофильности хроменилиевого цикла структура и, соответственно, окраска антоцианов и антоцианидинов обуславливается их чувствительностью к pH: в кислой среде (pH < 3) антоцианы (и антоцианидины) существуют в виде пирилиевых солей, при повышении pH до ~4-5 происходит присоединение гидроксидиона с образованием бесцветного псевдооснования, при дальнейшем повышении pH до ~6-7 происходит отщепление воды с образованием хиноидной формы, которая, в свою очередь, при pH ~7-8 отщепляет протон с образованием фенолята, и, наконец, при pH выше 8 фенолят хиноидной формы гидролизуется с разрывом хроменового цикла и образованием соответствующего халкона.

Антоцианы выделяются из растительного сырья хроматографией или экстракцией 1%-ным раствором HCL в метаноле.

Природным сырьём для получения антоцианов являются не только плоды черноплодной рябины, но и такие растения как черная смородина, каркадэ, красный виноград, черника и другие.

Антоцианы можно получить синтетическим путём из полигидроксибензальдегидов (схема 1).

Где В - остаток тетраацетилглюкозы.

Антоцианы относятся к вторичным метаболитам растений и служат им для защиты от неблагоприятных факторов, прежде всего от ультрафиолетового излучения, поражения вирусными инфекциями и плесенью. Они обладают широким спектром биологического действия и сочетают в себе антиоксидантные, бактерицидные, солнцезащитные свойства, обладают высокой капиляропротекторной (Р-витаминной активностью). Также антоцианы обладают красящими свойствами, то есть являются натуральными красителями [9].

 

 

 

 

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования использовали сырьё, собранное в 2012 году культивируемое в Кемеровской области.

Для получения водно-спиртового экстракта был использован метод мацерации с применением лабораторного реактора. Метод основан на настаивании измельчённого сырья с соответствующим экстрагентом в течение определённого времени [2]. Для ускорения процесса была применена турбо мешалка и поддержание повышенной температуры с помощью паровой рубашки реактора.

Приборы: блок регулирования температуры циркуляционный «МО1», мешалка верхнеприводная «RZR 2020», стеклянный реактор для лабораторного синтеза «Rad Ceys».

Реактивы: спирт 70%, содержащий 1% кислоты хлороводородной, вода дистиллированная, сухое измельчённое сырьё.

Далее проводился отгон спирта и концентрация экстракта с добавлением горячей воды и осаждением смолистых веществ.

Приборы: роторный испаритель «Heidolph», вакумный насос для фильтрования.

Затем проводился анализ полученного водно-спиртового экстракта по качественным и количественным характеристикам. Определяли антоцианы, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, флавоноиды, сумму фенольных соединений.

Реактивы: спирт 70%,  раствор железоаммонийных квасцов, раствор 10% средней соли ацетата свинца, раствор калий перманганата, хлороводородная кислота, металлический цинк, порошок магния, 1% спиртовой раствор щелочи, 0,5% растворо хлорного железа, 5% раствор алюминия хлорида,  1% раствором желатина, 5% раствор калия бихромата,  реактив Фолина-Дениса (смесь фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой кислот.

Использовали химическую посуду: пробирки, часовые стёкла, колбы для титрования, делительные воронки и другое.

Проводили хроматографический анализ методом тонкослойной хроматографии для качественного обнаружения антоцианов, флавоноидов, фенольных соединений. Метод ТСХ основан на различии в скорости перемещения компонентов смеси в плоском тонком слое (толщина 0,1-0,5 мм) сорбента при их движении в потоке подвижной фазы (элюента).

Реактивы: смесь растворителей: н-бутанол - кислота уксусная ледяная – вода (4:1:2).

Использовали хроматографическую пластинку со слоем силикагеля, на алюминиевой подложке, высокоэффективной (ПТСХ-АФ-В или аналогичного качества), размером 100×100 мм.

Спектрофотометрически определяли количественное содержание флавоноидов и антоцианов. Метод спектрофотомерии основа на измерении оптической плотности растворов.

Приборы: спектрофтометр СФ-2000

Для фракционирования использовали следующие органические растворители: хлороформ, гексан, этилацетат, бутанол.