Разработка методик качественного и количественного анализа действующих веществ экстракта плодов аронии черноплодной

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Получение водно-спиртового экстракта

Получали экстракт сухих плодов аронии черноплодной методом мацерации. Измельчали сырьё в измельчителе, чтобы оно проходило через сито с размером пор 1см.

Коэффициент спиртопоглощения 0,7. Использовали 70% спирт, содержащий 1% кислоты хлороводородной.

Готовили экстракт в соотношении 1:5, и тогда для получения 400мл экстракта потребуется 80г сырья. Количество экстрагента 456мл (с учётом коэффициента).

Влажность сырья (1 порции 80г) 5,417%

Методика: Аналитическую пробу сырья измельчили до размера частиц около 10   мм,  перемешали и взяли две навески массой 3-5  г,  взвешенные  с   погрешностью  +/- 0,01 г. Каждую навеску поместили в  предварительно   высушенную и взвешенную вместе с крышкой бюксу и поставили в  нагретый до 100-105° С сушильный шкаф. Время высушивания отсчитывали  с  того  момента, когда температура в сушильном шкафу вновь  достигнет   100-  105°С. Первое взвешивание плодов через 3 ч.    Высушивание  проводили  до  постоянной массы [6]. 

       Определение  потери  в  массе  при  высушивании  для  пересчета   количества  действующих  веществ и золы  на  абсолютно  сухое  сырье   проводили   в   навесках   1-2  г  (точная   навеска).

       Влажность  сырья (X) в процентах вычисляют  по формуле:  

                                (m - m1)100

                          Х = --------------,

                                    m  

   где  m  -  масса  сырья до высушивания в граммах; m1 -  масса  сырья

   после высушивания  в граммах.

Схема (схема 2) процесса экстракции представление следующим образом:

 

         3.2. Качественный анализ

Определение фенольных соединенений

А) Реакция с железоаммонийными  квасцами. К 2-3 мл извлечения добавляли несколько капель раствора железоаммонийных квасцов. О наличии в сырье фенольных соединений свидетельствует появление черно-синего или черно-зеленого окрашивания и осадка.

Б) Реакция с ацетатом свинца. К 1 мл извлечения добавляли 2 мл раствора 2% уксусной кислоты и 1 мл раствора 10% средней соли ацетата свинца. В уф свете наблюдалось ясно-голубое окрашивание [12].

Опеределение фенолкарбоновых кислот

Хроматографическое определение: 0,05 мл спиртового извлечения наносили микропипеткой или микрокапилляром на линию старта хроматографической бумаги EFN – 12 (Германия) размером 60 х 9 см в виде тонкой линии 10мм, рядом наносили в виде тонкой линии также в 10 мм 0,05 мл раствора достоверного образца кислоты хлорогеновой. Хроматографическую бумагу с нанесенными пробами высушивали на воздухе в течение 5 мин, затем помещали в камеру (предварительное насыщение камеры не менее суток), содержащую 70% раствор кислоты уксусной и хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей прошел 58 см, хроматографическую  бумагу вынимали из камеры, высушивали в вытяжном шкафу в течение 10 мин и просматривали в УФ-свете при длине волны 360 нм (рис. 3). На уровне пятна достоверного образца хлорогеновой кислоты должно наблюдаться пятно желтого цвета, которое и было нами идентифицировано. При этом допустимо наличие других пятен.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3 - Схема хроматограммы на бумаге на ФКК в плодах аронии черноплодной (система: 70% раствор кислоты уксусной): 1 – известный образец (хлорогеновая кислота); 2 – спиртовое извлечение плодов аронии черноплодной.

Опеределение флавоноидов

А) Проба Синода. Взяв три пробирки с одинаковым количеством полученного экстракта (1 мл), в них прибавляли по 5 капель концентрированной кислоты хлористоводородной. Затем в одну из пробирок добавляли несколько крупинок металлического цинка, во вторую – порошок магния, в третьей оставался только фильтрат. Все пробирки нагревали на водяной бане до кипения и оставляли для охлаждения на 5-10 минут. О присутствии в извлечении флавоноидов свидетельствует окраска продукта реакции, которая зависит от группы флавоноидов. Третья пробирка контрольная: появление розового или красного окрашивания в ней указывает на наличие антоциановых пигментов, халконов и ауронов.

Б) Реакция со щелочью. К 0,5 мл полученного выше спиртового извлечения добавляли несколько капель 1% спиртового раствора щелочи. Флавоны и флавонолы растворяются в щелочах с образованием желтой окраски. Антоцианы дают синее или фиолетовое окрашивание.

В) Проба с 0,5% раствором хлорного железа. К 0,5 мл полученного выше спиртового экстракта добавляли 1-2 капли раствора хлорного железа. Давать окраску с хлорным железом – общее свойство полиоксифенольного соединения. Ортооксифенольные группы в молекулах флавоноидов обуславливают зеленую, а триоксифенольные группы – синюю окраску.

Г) Проба с алюминия хлоридом. К 1 мл спиртового извлечения добавляли 3-5 капель 5% спиртового раствора реактива. При наличии флавоноидов появляется грязно-желтое окрашивание [5, 12].

Д) Хроматографическое определение. Испытуемый раствор. Около 2,0г сырья, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл 95 % спирта этилового, закрывали пробкой и перемешивали в течение 30 мин на встряхивающем аппарате. После охлаждения извлечение фильтровали через бумажный фильтр.

На линию старта хроматографической пластинки со слоем силикагеля, на алюминиевой подложке, высокоэффективной (ПТСХ-АФ-В или аналогичного качества), размером 100×100 мм, проведенную на расстоянии 1,5 - 2 см от нижнего края пластинки, микропипеткой наносили 0,02 мл извлечения в виде пятна диаметром около 5 мм. В качестве заведомо известных веществ сравнения наносили по 0,02 мл растворы рутина и кверцетина также в виде пятен диаметром около 5мм. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе при комнатной температуре, затем помещали в хроматографическую камеру (выложенную изнутри фильтровальной бумагой, предварительно насыщенную не менее 24 часов) с верхним слоем смеси растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота – вода (4:1:2) и хроматографировали восходящим методом.

Когда фронт растворителей прошел не менее 8 см от линии старта, пластинку вынимали из камеры, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления следов растворителей и просматривали в видимом и УФ - свете.

На хроматограмме испытуемого раствора на уровне пятна достоверного образца рутина обнаруживали зону адсорбции в виде пятна желтого цвета, которая полностью совпадала с зоной адсорбции спиртового извлечения из плодов аронии черноподной (Rf - 0,57). При этом допускается обнаружение дополнительных зон (рис. 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 4 - Схема ТСХ на флавоноиды в плодах аронии черноплодной ( система: н-бутанол - кислота уксусная ледяная – вода (4:1:2)): 1 – известный образец раствора рутина; 2 – известный образец раствора кверцетина; 3 - спиртовое извлечение плодов аронии черноплодной.

 

 

 

Определение дубильных веществ

А) Осаждение 1% раствором желатина: к 2 мл испытуемого раствора добавляли по каплям 1% раствор желатина в 10% растворе натрия хлорида. При наличии дубильных веществ появляется осадок, исчезающий при добавлении избытка желатина.

Б) Реакция с калия дихроматом:  к 3-5 мл извлечения добавляли 2-3 капли 5% раствора калия бихромата. При наличии таннидов наблюдается потемнение раствора или выпадение желто-коричневого осадка.

В) Реакция с реактивом Фолина-Дениса (смесь фосфорномолибденовой и фосфовольфрамовой кислот). К 3-5 мл извлечения добавляли 3-5 капель реактива Фолина-Дениса и небольшое количество натрия карбоната. При наличии таннидов образуется вольфрамовая или молибденовая синь. Окраска устойчива. Эта реакция может быть использована для количественного определения дубильных веществ [5, 12].

Опеределение антоцианов

 А) К 1 мл испытуемого раствора прибавляли 1 мл 1 % кислоты хлористоводородной, раствор окрашивался в интенсивно красный цвет.

Б)  В пробирку помещали 0,5 мл извлечения и добавляли 0,5 мл 10% раствора натрия гидроксида. В присутствии антоцианов появлялось окрашивание сине-зеленого цвета.

В) Метод ТСХ.  На линию старта хроматографической пластинки со слоем силикагеля, на алюминиевой подложке, высокоэффективной (ПТСХ-АФ-В или аналогичного качества), размером 100×100 мм, проведенную на расстоянии 1,5 - 2 см от нижнего края пластинки, микропипеткой наносили 0,02 мл извлечения в виде пятна диаметром около 5мм. Пластинку с нанесенными пробами высушивали на воздухе при комнатной температуре, затем помещали в хроматографическую камеру (выложенную изнутри фильтровальной бумагой, предварительно насыщенную не менее 24 часов) с верхним слоем смеси растворителей: н-бутанол - кислота уксусная ледяная – вода (4:1:2) и хроматографировали восходящим методом.

Когда фронт растворителей прошел не менее 8 см от линии старта, пластинку вынимали из камеры, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления следов растворителей и просматривали в видимом свете.

На хроматограмме испытуемого раствора наблюдали зону адсорбции фиолетового цвета с величиной Rf около 0,35 (цианидин – 3-О- глюкозид); возможно присутствие розового пятна с величиной Rf около 0,5 (гликозид мальвидина); допускается обнаружение дополнительных зон (рис. 5).

Известно также, что в данной системе растворителей стандартный образец цианидин-3-О- глюкозида дает Rf -  0,35.Это дает нам возможность утверждать, что в извлечениях из плодов аронии   черноплодной присутствует данное вещество.

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 5 - Схема ТСХ на антоцианы в плодах аронии черноплодной

( система: н-бутанол - кислота уксусная ледяная – вода (4:1:2)):

1 – спиртовое извлечение  плодов аронии черноплодной;

2 – спиртовое извлечение  черники обыкновенной

Для уточнения данных нами была использована ТСХ не только для плодов аронии черноплодной, но и для плодов черники обыкновенной, для которой известно из литературных данных значение Rf для цианидин-3-О-глюкозида, равное 0,35. Для этого, из плодов черники обыкновенной было получено спиртовое извлечение аналогично методике для плодов аронии и проведена ТСХ паралельно этих двух извлечений на одной хроматографической пластинке. По результатам хроматограммы в тонком слое сорбента были идентифицированы фиолетовые пятна, с величиной  Rf = 0,35 как у плодов аронии, так и у плодов черники обыкновенной, что позволяет нам судить о наличие цианидин-3-О-глюкозида в плодах аронии (рис. 5).

Таблица полученных результатов качественного определения (табл.1)

Таблица 1. Качественный анализ экстракта

 

Исследуемые вещества	Наличие веществ в экстракте
Фенольные соединения	+
Фенолкарбоновые кислоты	+
Флавоноиды	+
Дубильные вещества	+
Антоцианы	+

 

 

 

 

 

 

 

2. Количественный анализ

Определение суммы флавоноидов

Определяли спектрофотометрическим методом с использованием комплексообразующей реакции с алюминия хлоридом [5,12]. Показания снимали в УФ-области при длине волны 410 нм.

Количественное содержание флавоноидов в пересчёте на рутин и абсолютно сухое сырьё колебалось в пределах от 5,20% до 5,80%.

 

Определение дубильных веществ 

Использовали методику, предложенную Г.М.Федосеевой с соавторами, в которой проведено осаждение дубильных веществ раствором желатина и повторное титрование фильтрата калия перманганатом. По разнице объемов титрования рассчитывали содержание в сырье дубильных веществ [5,12].