Патоморфологические изменения кота при листериозе

Отсутствие адсорбции может быть также обусловлено обволакиванием рецепторов слоем какого-либо другого вещества, как, например, у сальмонелл при мутации от шероховатой формы к гладкой / Prehм е. а1. 1976/. По мнению ряда авторов / Luria, Selbruc , 1943/, Г. Стент /1974/ формирование фагорезистентности является результатом спонтанной мутации, а фаг выполняет роль селективного фактора. Кузнецовой В. /1963/ установлено, что появление свойства фагорезистентности необязательно связано с присутствием фага в среде и может возникнуть под влиянием разнообразных воздействий, среди которых важную роль играют антибиотики.

Не исключена возможность, что животные, от которых получены фагорезистентные штаммы, также обрабатывались антибиотиками.

Таким образом , механизм получения устойчивых к фагу культур пока что остается неясен.

Изучение диапазона литического действия листериозных бактериофагов показало высокую их специфичность. Литический спектр фагов l 2А и L 4А не выходят за пределы бактериального вида. При испытании 48 штаммов других видов бактерий, в число которых вошли микроорганизмы, встречающиеся как сопутствующая микрофлора при листериозе /кишечная палочка/ и имеющие антигенное родство /стафилококки/, ни в одном случае не было отмечено наличие чувствительности к литическому действию листериозных фагов.

Особый интерес представляет отсутствие литической активности листериозных фагов по отношению к стафилококкам, имеющим антигенное родство с антигенами листерий.

В экспериментах К.Н. Шлыгиной /1970/ установлено, что перекрёстные серологические реакции у листерий, стафилококков и энтерококков обуславливаются наличием видонеспецифического антигена Рантца, входящего у листерий в состав антигенных факторов. Исходя из полученных данных можно считать, что указанный антиген не является структурным компонентом фаговых рецепторов, чем и объясняется высокая специфичность листериозных бактериофагов по сравнению с серологическим тестом. Определённую ценность имеет работа B.a'atson" 7.3valand /1966/, в которой с помощью флуоресцирующих антител, используемых для демонстрации прикрепления фагов к микробной клетке, доказано отсутствие у листериозных бактериофагов способности адсорбироваться на золотистом стафилококке, имеющих антигенное родство с листериями, .Листериозные бактериофаги 2А и L4A, обладающие высокой видовой специфичностью, могут в значительной степень облегчить задачу дифференциации листерий от антигенно родственных микроорганизмов.

Как указывает В.Д. Тимаков и Д.М.Гольдфарб /1956/, идентификация возбудителей инфекционных заболеваний при помощи бактериофагов является очень тонким методом, превосходящий по чувствительности все известные иммунологические реакции, добавим кроме ИФА, РИА.

Полученные результаты исследований по определению специфичности и спектра литической активности листериозных бактериофагов 2А 4А показывают, что они относятся к числу активных диагностических фагов, дающих возможность идентифицировать свыше 90% культур листерий. Кроме того, различная активность фагов в отношении листерий 1 и 2 серогрупп, позволяет использовать их с целью серогрупповой идентификации.

Полученные результаты по изучению специфичности бактериофагов 2А и l 4А позволили перейти к разработке оптимальных условий постановки РНФ для обнаружения возбудителя листериоза в различныx субстратах. В первую очередь для постановки РНФ были испытаны различные питательные среды. На основании этих экспериментов было показано, что среда, содержащая 0,5% глюкозы обеспечивает лучшую репродукцию фаговых корпускул и позволяет учитывать результаты РНФ на 6 часов раньше, чем на средах без содержания глюкозы.

Указанные выводы о зависимости эффективности в проведении РНФ от используемой питательной среды совпадают с данными Н.А. Капыриной /1974/. Она считает, что инкубирование листерий зараженных фагом, в обогащенной среде, к числу которых относится и бульон Мартена с глюкозой, способствует не только интенсификации внутриклеточного цикла развития вирусных частиц, но и повышает количественное содержание вновь образовавшихся потомков фага в клетке.

Использование при постановке РНФ таких, общедоступных для любой бактериологической лаборатории, питательных сред как : МПБ 1,5 и 0,7% МПА с 0,5 % глюкозой значительно упрощает и облегчает применение РНФ в сравнении с методами бактериологического исследования. Эффективность РНФ от состава питательных сред отмечали и другие исследователи: М.Абдусаматов /1960/, И.В. Дoмapaдcкий с соавт. (1958), С.Е. Филичкин (1965) , В.Э. Шнейдерман (1963) при обнаружении воэбудителей дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллезе, холеры.

В последующих опытах определяли количественный показатель листериозного фага, имеющий диагностическое значение. Из литературы /Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. 1962/ известно, что при обнаружении дизентерийных бактерий РНФ считают отрицательной, если увеличение количества фага в опытной пробе по сравнения с контрольной составляет до 3 раз. Увеличение количества фага от 3 до 5 раз учитывается как слабо положительная реакция; от 5 до 10 раз – положительная, свыше 10 – резко положительная. При постановке диагноза, методом РНФ, на брюшной тиф Д.М. Гольдфарб, З.С.Островская /1957/ считали РНФ cлaбo положительной, если увеличение количества фага было лишь в 2,5 раза. При увеличении этого показателя в 3-5 и более раз РНФ диагноз считали положительным.

Для определения количества фага, имеющего диагностическое значение при обнаружении возбудителя листериоза, было проведено свыше двух сотен исследований различных субстратов ( МПБ, вода, почва) контрольных и инфицируемых культурой листерий обеих серогрупп в концентрации от 10 до 100 000 000 м.т. в мл.

В результате проведенных исследований установлено, что РНФ положительна в случае, если количество "стерильных пятен" на чашках Петри, засеянных из опытных проб, было в 5 рaз больше по сравнению с контролями титра фагов.

Выбранный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличения количества фага. Достоверность РНФ определяли путём выделения возбудителя листериоза бактериологическим методом исследования и специфичностью РНФ с контрольными пробами.

Выбрав питательную среду для постановка РНФ и определив количество фага, имеющее диагностическое значение при обнаружении возбудителя листериоза в исследуемых субстратах, были начаты исследования по разработке режима PНФ. Для этой цели были поставлены эксперименты с использованием двух основных модификаций, заключающихся в предварительном проращивании или увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом.

При отработке вопросов предварительного подращивания исследуемого материала использовали 7 режимов, различающихся по времени данного процесса (1, 2, 3, 4, 16 часов) и условиям аэрации /шуттелирование/. После предварительного подращивания к исследуемому субстрату добавляли определённое количество фага и смесь выдерживали при температуре 28°С в течение 8 часов. В результате этих исследований было показано, что при подращивании изучаемого материала в течение 16 часов при температуре 37 С РНФ оказалась менее чувствительной, так как позволяла обнаруживать 105 м.т. в мл. Вероятно, при столь длительной экспозиции /16 часов/ культивирования при температуре 37°С сильно развивается посторонняя микрофлора, которая оказывает антагонистическое действие на листерии.

При подращивании исследуемого материала в течение 2-х часов при шуттелировании или 3-4 часа без шуттелирования при температуре 37°С, мы могли обнаружить листерии в исследуемом материале в количестве 103 м.т./мл. Таким образом, эти режимы подращивания мы считаем оптимальными. Для выяснения оптимального времени контакта исследуемого материала с фагом было испытано 5 параметров. В результате этих исследований установлено, что при культивировании исследуемого субстрата с фагом в течение 6 часов при температуре 28°С заметное нарастание количества листериозного фага наблюдается при концентрации гомологичных бактерий не менее 105 в мл. Удлинение сроков инкубации /16-24 час./ дало возможность получить увеличение количества фага в пределах, имеющих диагностическое значение уже при концентрации листерий 102 до 103 м.т. в мл.

Исходя из выше изложенного можно предположить, что значение инкубации смесей в течение I6-24 часов при температуре 22°С или 28°С сводится к тому, что за это время бактерии, находящиеся в исследуемом субстрате в очень малых количествах, размножаются. В результате этого между добавленным индикаторным фагом и бактериями устанавливаются такие количественные соотношения, при которых вероятность встречи между ними повышается и бактерии инфицируются фагом. Отсюда вытекает, что исход реакции зависит не только от свойств индикаторного фага, но и от биологических особенностей данного возбудителя, обнаруживаемого с помощью РНФ.

При этом, как пишет А.П.Пехов /1962/: "Взаимодействие фагов и бактерий представляет собой сложный биологический процесс, характеризующийся полной зависимостью биологии фагов от биологии бактерий и тесной связью жизни бактерий с развитием фагов".

Ранее В.А. Тимаковым и Д.М.Гольдфарбом (1960) было показано, что чувствительность реакции является функцией времени и концентрации бактерий. Из этого следует, что, как и при выявлении других микроорганизмов, чувствительность РHФ при экспериментальном листериозе является функцией времени и концентрации бактерий. Удлинение срока контакта исследуемого субстрата с фагом способствует выявлению бактерий при незначительном содержании их в объекте исследования. Таким образом, из числа испытанных pежимов наиболее быстрым, но менее чувствительным, является подращивание исследуемого материала в течение 3 часов при температуре 37°С с последующим контактом исследуемого материала с фагом при температуре 28 0 в течение 8 часов. Учёт результатов проводят в этом случае через 24 часа. Бактерии удается обнаружить в количестве 103 м.т./мл /г/.

Наиболее чувствительным, но более длительным, методом является выдерживание исследуемого материала с фагом /без предварительного подращивания/ в течение 24 часов при комнатной температуре или температуре 280°С. При данном режиме выявляются листерии в концентрации 102 м.т. мл.г/, на проведение РНФ затрачивается не более 48 часов. Этот метод наиболее удобен в практических условиях лаборатории.

Установив специфичность и спектр литической активности листериозных фагов, и разработав условия и режим постановки РНФ, необходимо было изучить возможность использованная РИФ для обнаружения листерий, прежде всего, в органах и тканях животных. Для этой цели были использованы органы 20 кроликов и 11 овец, павших в результате экспериментального заражения культурой листерий 1 и 2 серогрупп. В качестве контроля в этих экспериментах использовали органы от 10 интактных (незараженных) животных. Для подтверждения специфичности при обнаружении листерий в исследуемых органах было проведено бактериологическое исследование. Листерии в исследуемых органах идентифицировали с помощью листериозных бактериофагов 2А и l 4А методами накапывния и РНФ.

2. Протокол вскрытия

Вскрытие трупа кота возраст 2 года, кличка Барсик, беспородный, владелец Забегайлов, производили ветврач Кондрущенкова С.Ю. в присутствии главного ветврача станции Батырова А.А. в помещении операционной 19.11.2012 г.

Анамнез

Животное было подобрано с улицы весной 2011 г., в возрасте около 6 мес. В июне 2011 г. кота кастрировали. Кот содержался в домашних условиях, на протяжении последних полутора лет получал сухие корма «Whiskas», «Kitekat», «Katinka», а также иногда рыбу и мясо.

8 ноября 2012 г. владельцы кота  заметили многократные, но безрезультатные  попытки мочеиспускания и общее  ухудшение состояния животного (угнетение, отказ от корма). 10 ноября 2012 г. кот был доставлен для осмотра и лечения на районную станцию по борьбе с болезнями животных (рег. № 197 по амбулаторному журналу).

При осмотре объективно было установлено: ректальная температура 37,6° С, пульс 120 уд/мин., частота дыхания 20 мин-1; слизистая оболочка ротовой полости, конъюнктива покрасневшие; живот вздут, болезненный при пальпации; в животе обнаруживается переполненный (Æ>10 см) мочевой пузырь; почки увеличены, болезненны при пальпации. Проведенная катетеризация мочевого пузыря выявила обструкцию уретры на уровне седалищной вырезки. Лабораторное исследование выведенной мочи позволило установить диагноз: струвитный уролитиазис, острая задержка мочи.

Лечение кота, начатое 10.11.2012 г., включало в себя внутримышечные инъекции баралгина (по 0,5 мл), викасола (по 0,5 мл), подкожное введение раствора глюкозы (5%-20 мл) с димедролом. Внутрь был назначен метионин по 1/2 таб. 2 р. в день и диетический корм (Whiskas low pH-control diet). Лечение продолжалось в течение девяти дней; весь этот период состояние кота постепенно ухудшалось и в ночь на 19.11.2012 г. кот погиб.

Труп кота доставлен для вскрытия в районную станцию по борьбе с болезнями животных 19 ноября 2012 года.

Описательная часть

НАРУЖНЫЙ ОСМОТР

1. Труп кота вышесредней упитанности лежит на правом боку, передние конечности параллельно вытянуты в положении максимального разгибания. Задние конечности согнуты в тазобедренных, коленных и запплюсневых суставах. Голова и шея вытянуты в положении разгибания.
2. Вес трупа около 4 кг, длина тела 45 см. Телосложение пропорциональное, конституция крепкая.
3. Температура трупа около 20° С. Окоченение выражено на жевательной мускулатуре, а также мышцах шеи и передних конечностей. На других участках тела окоченение выражено слабо. Трупные пятна отсутствуют. Трупное разложение не отмечено.
4. Шерстный покров равномерный. Шерсть рыжего цвета, взъерошена, тусклая, удовлетворительно удерживается в коже в области промежности и задней поверхности бедер испачкана жидкостью темно-красного цвета с запахом мочи.
5. Кожа желтоватого цвета дряблая, в области передней поверхности правого предплечья - синие пятна: следы внутривенных инъекций.
6. Ушные раковины подвижные, слуховой проход загрязнен незначительным количеством ушной серы светло-коричневого цвета.
7. Глаза открыты, слегка запавшие, веки подвижные, без повреждений; конъюнктива красного цвета, липкая, дряблая; роговица прозрачная; зрачок расширен.
8. Ротовое отверстие закрыто, кончик языка выставлен наружу. Окружность губ сухая, чистая.
9. Нос красноватого цвета, вокруг носовых отверстий тонкие белые корочки.
10. Анальное отверстие открыто, запавшее, по окружности слегка испачкано фекальными массами черного цвета.