Антифосфолипидный синдром

Антитела к аннексину V

Причиной невынашивания на более  поздних сроках при прогрессировании АФС является развитие тромботической васкулопатии спиральных артерий плаценты. Доказана роль аннексина V в генезе синдрома потери плода у больных АФС, снижение которого на поверхности ворсинок приводит к развитию тромбозов и инфарктов плаценты.

Аннексин V , также известный как плацентарный антикоагулянтный протеин ( PAP I ), принадлежит семейству кальций-зависимых белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V представлен во многих тканях, главным образом на эндотелиальных клетках и плаценте. В низких концентрациях аннексин V присутствует в тромбоцитах, в более высоких - в эритроцитах и лейкоцитах. Он обладает выраженными антикоагулянтными свойствами. Это свойство аннексина V обусловлено его высоким сродством к анионным фосфолипидам и способностью препятствовать активированным факторам свертывания крови связываться с фосфолипидами клеточных мембран. Сродство аннексина V к ФС в 1000 раз выше, чем протромбина.

Плазматическая мембрана клетки характеризуется ассиметричной структурой и исчезновение этой структуры служит первым признаком апоптоза. При нормальных условиях ФС локализуется на цитоплазматической стороне клеточной мембраны, в то время как при апоптозе он находится на наружной поверхности мембраны, где высокоспецифично связывается с аннексином V . Аннексин V покрывает ФС по типу ковра, оказывая местный антикоагулянтный эффект. Поэтому во время физиологической беременности, несмотря на длительное расположение ФС на поверхности трофобласта, не происходит постоянного тромбообразования. У больных АФС, в том числе на фоне инфекционного процесса, возможна выработка аутоАТ к этому белку. Эти АТ вытесняют аннексин V с поверхности эндотелиоцитов и клеток трофобласта, что приводит к гиперкоагуляции и потери беременности. По мере прогрессирования беременности процессы тромбообразования в сосудах плаценты становятся все более значимыми. 

Антитела к протромбину 

АТ к протромбину являются патогенными  и напрямую ингибируют факторы коагуляции, что приводит к удлинению времени фосфолипид-зависимых коагуляционных тестов. Протромбин (фактор II свертывания) - витамин К-зависимый гликопротеин, синтезируемый в печени и участвующий в свертывании крови. Протромбин обеспечивает создание на мембране поврежденных клеток комплекса факторов Va , Xa , и фосфолипидов. В результате чего образуется протромбиназный комплекс, который осуществляет расщепление протромбина до тромбина, что в дальнейшем приводит к превращению фибриногена в фибрин. Совсем недавно были проведены исследования, которые показали, что АТ, являющиеся причиной возникновения эффекта ВА (удлинение времени фосфолипид-зависимых коагуляционных тестов), требуют присутствия плазменных протеинов, подобных b 2-ГП I или протромбину. Протромбин был идентифицирован как первый кофактор действия АТ, обеспечивающих эффект ВА. Специфичность определения АТ класса IgM к протромбину составляет 97%, IgG - 95%. АТ класса IgM к протромбину обнаруживают у 12, IgG - у 14% больных СКВ. У пациентов с первичным АФС повышенный уровень АТ класса IgM к протромбину выявляют в 27%, IgG - в 18% случаев заболевания.

Наличие аутоАТ к протромбину связано  с тромбозом у пациентов с  СКВ и АФС. Было также найдено, что высокие уровни АТ к протромбину  связаны с риском глубокого тромбоза вен, легочной эмболии. Кроме того, было показано, что повышение концентрации АТ к протромбину является прогностическим фактором риска инфаркта миокарда.

Основы лабораторной диагностики "антифосфолипидного синдрома"

16-06-2011

Под термином "антифосфолипидный синдром" (АФС) объединяется группа аутоиммунных нарушений, характеризующаяся наличием в крови в высоком титре антител к содержащимся в плазме отрицательно заряженным мембранным фосфолипидам - фосфатидилсерину, кардиолипину и др., а также к связанным с этими фосфолипидами гликопротеинам (бета2-гликопротеину-I, аннексину V и/или протромбину). Другой важной характеристикой этого синдрома является нарушение ряда параметров свертываемости крови - развитие гипокоагуляции в различных так называемых фосфолипид-зависимых тестах, выполняемых на бедной тромбоцитами плазме (БТП). Эта гипокоагуляция, которая обозначается как наличие в плазме крови антикоагулянтов волчаночного типа (АВТ), устраняется или становится значительно менее выраженной при добавлении к БТП эмульсии нормальных фосфолипидных мембран, полученных из разрушенных тромбоцитов, либо эритрофосфатида [2,5].

Антифосфолипидный синдром является одним из наиболее часто встречающихся  видов тромбофилии, в связи с  чем его распознавание должно включаться в диагностический процесс во всех случаях ранних и, особенно, рецидивирующих венозных и артериальных тромбозов различной локализации, тромбоэмболий, динамических нарушений мозгового кровообращения и ишемических инсультов, в том числе протекающих с синдромами мигрени, нарушениями памяти, парезами, эпи-синдромом, нарушениями зрения и другими церебрально-сосудистыми проявлениями, а также при упорном невынашивании беременности (внутриутробная гибель плода, выкидыши), наличии ливедо, умеренной тромбоцитопении, сочетающейся с тромбозами и ишемическими явлениями, ложно положительной реакцией Вассермана и другими проявлениями [1,3,4,9,25,]. При этом следует учитывать, что наряду с так называемым "первичным антифосфолипидным синдромом" часты случаи его сочетания с системной красной волчанкой, узелковым периартериитом и другими заболеваниями аутоиммунной природы, а также с вирусными и лимфопролиферативными болезнями, меняющими иммунный статус организма. Эти формы обозначаются как "вторичный АФС" и в их симптоматику входят как признаки основного заболевания, так и АФС. К вторичному АФС могут быть отнесены и случаи этой формы патологии, возникающие вследствие ряда лекарственных воздействий, которые трактуются как гаптеновые иммунные антифосфолипидные синдромы.

В процессе многолетних наблюдений более, чем над 800 больными с АФС, многие из которых направлялись в наш центр для уточнения диагноза и проведения лечения, мы неоднократно сталкивались с рядом типичных ошибок, допускавшихся при распознавании АФС, в результате чего он либо не выявлялся, либо, что наблюдалось несравненно чаще, диагностировался ошибочно у больных, у которых в действительности этого синдрома не было. Среди ошибок в распознавании АФС такая гипердиагностика имела место более, чем в 70% случаев. Анализ этих ошибок показал, что они связаны, в основном, со следующими причинами:

Недостаточно полным обследованием  больных и применением ограниченного  числа рекомендуемых для такой  диагностики тестов [2,11,17, 18, 26]. Так, мы неоднократно сталкиваемся с тем, что диагноз АФС ставится лишь на основании одного антикардиолипинового теста без определения антител к другим фосфолипидам и без выявления эффектов так называемых "волчаночных антикоагулянтов". Между тем известно, что антикардиолипиновый тест, несомненно являющийся наиболее "ходовым" и стандартизированным, обладает сравнительно низкой специфичностью, поскольку кардиолипин является компонентом лишь мембран внутриклеточных органелл, содержится в большом количестве в плазме здоровых людей, будучи в ней заблокирован другими компонентами [10] и бывает положительным не только при АФС, но и при других видах патологии [11,15, 19]. В силу этого, антикардиолипиновый тест при всей своей высокой стандартизации и воспроизводимости должен дополняться другими методами иммунологической диагностики (см. ниже), а также комплексным определением эффектов волчаночных антикоагулянтов. К этому нужно добавить, что антикардиолипиновый тест может считаться положительным лишь при очень высоких его показаниях, превышающих в несколько раз нормальный уровень этих антител. Вместе с тем, в настоящее время подчеркивается необходимость определения при АФС не только антикардиолипиновых антител, но и титра антител к другим мембранным фосфолипидам (фосфатидилсерину и др.), для чего ряд фирм (Stago и др.) выпускают тест-системы, содержащие антитела как к отдельным мембранным фосфолипидам, так и к их смесям.

Иммунодиагностика АФС согласно современным рекомендациям  должна включать в себя помимо определения  титра антифосфолипидных антител, принадлежащим к разным классам иммуноглобулинов, исследование антител к некоторым гликопротеинам, фиксированным на фосфолипидных мембранах. Важнейшими из них являются бета2-гликопротеин-I (бета2ГП-I), аннексин V и протромбин. Соответствующие диагностикумы также выпускаются рядом фирм (Stago, Loxo и др.). Для повышения точности диагностики и уточнения степени тромбогенности иммунного процесса существенное значение имеет определение титра антител хотя бы к одному из этих белков. Наиболее показательно в этом отношении определение титра антител к бета2-ГП-I, о чем говорит множество публикаций и докладов на Международных конференциях, посвященных антифосфолипидному синдрому, в том числе и работы нашей клиники [11, 20]. В настоящее время разрабатываются также методики определения в сыворотке крови титра антител к белково-фосфолипидным неоантигенам.

Следует иметь  в виду, что и при достаточно полном иммунологическом обследовании значительная часть случаев АФС (по разным данным в пределах 35-60%) остается нераспознанным, если одновременно не определяются в плазме антикоагулянты волчаночного типа. Последние также неоднородны как и антифосфолипидные антитела, в связи с чем их выявление должно проводиться полным комплексом предложенных для этого методик. Недопустимо также применение с этой целью недостаточно проверенных "доморощенных" методов и их модификаций, не прошедших сравнения с признанными эталонными тестами. Мы это подчеркиваем, поскольку такими мало пригодными для использования в диагностическом процессе методиками очень засорена отечественная литература, что часто служит источником ошибочной постановки диагноза АФС, неправильного лечения больных. В этом мы неоднократно убеждались, подвергая повторному обследованию больных, направленных на консультирование в нашу клинику с якобы уже установленным АФС.

Иначе говоря, подобно тому, как один иммунологический тест не обеспечивает надежного распознавания  АФС, выявление эффектов волчаночного антикоагулянта также требует использования  полного комплекса предложенных для этого фосфолипид-зависимых скрининговых и подтверждающих методик, прошедших апробацию в многоцентровых исследованиях [2, 17, 18, 21, 27]. К сожалению в большинстве отечественных работ, посвященных АФС, в том числе и выполненных в крупных научных центрах, мы не встречаем такой четко построенной идентификации эффектов АВТ, без чего диагностика этого синдрома не может считаться достаточно обоснованной. Ниже будут рассмотрены основные принципы идентификации АВТ и иммунологических маркеров АФС.

Способы выявления  и идентификации АВТ

Все включаемые в эту группу исследования выполняются  на бедной тромбоцитами плазме (БТП). Они  состоят из групп скрининговых и  подтверждающих коагуляционных тестов, выполняемых либо мануально, либо на коагулометрах современных конструкций, но не на устаревших электрокоагулометрах и тромбоэластографах. Из скрининговых тестов наиболее доступным, но наименее специфичным является определение каолинового времени свертывания БТП. Наличие волчаночного антикоагулянта (ВА) может быть заподозрено при удлинении каолинового времени более, чем в 1,25 раза по сравнению с контролем. Вместе с тем следует помнить, что многие ВА не влияют на этот показатель и что его нарушение может быть обусловлено не только эффектами ВА, но и другими причинами.

Намного более  информативны определения АЧТВ (АПТВ), но выполняемые не с обычными, а со специальными фосфолипидами, высоко чувствительными к действию ВА. Для этого, в качестве международных эталонов, признанных золотым стандартом, применяют диагностикумы, содержащие Platelin LS (фирмы "Organon-Teknika") или Staclot-LA (фирмы "Stago"). Многолетние испытания, проводившиеся в нашей лаборатории, подтвердили высокую информативность этих тестов. Под влиянием АВТ время свертывания в них удлиняется по сравнению с эталонной нормальной плазмой в 1,2 раза и более. Наличие ВА затем подтверждается другими скрининговыми и коррекционными пробами (см. ниже).

Особое  место в выявлении ВА занимают тесты с фосфолипид-зависимыми коагулазами  змеиных ядов. За рубежом с этой целью используется определение времени свертывания при добавлении к исследуемой БТП больного и к контрольной плазме разведенного яда гадюки Рассела [21,22,27]. В нашей лаборатории показано, что с этой же целью может быть использован коагуляционный тест с разведенным ядом среднеазиатской гюрзы (Vipera lebetina turanica), коагулаза которого по основным механизмам действия очень близка к коагулазе яда гадюки Рассела [12]. В больших сериях исследований, в том числе выполненных в нашем центре, показано, что коагуляционные тесты с фосфолипид-зависимыми разведенными змеиными ядами дают высокую корреляцию с показанием пробы с Platelin LS (коэффициент корреляции r =0.9; 0,02).

Для уточнения  степени нарушения показаний  фосфолипид-зависимых ядовых тестов используется определение отношения  показателей времени свертывания, полученных в этих тестах, к времени свертывания, полученного в тестах с коагулазами ядов, не чувствительных к эффектам волчаночного антикоагулянта. С этой целью за рубежом чаще всего используется определение отношения времени свертывания в тесте с разведенным фосфолипид-чувствительным ядом змеи Pseudonaja textilis (текстарином) к свертыванию в тесте с фосфолипид-нечувствительным ядом Echis carinatus (песчаной эфы) [28]. Оба эти яда являются активаторами фактора II.

В нашем центре разработан аналогичный индекс, отражающий отношение времени свертывания в тестах с ядом гюрзы и эфы (Echis multisquamatus) той же активности. Показания последнего не зависят от участия в процессе свертывания фосфолипидных мембран [2, 5]. Определение этих индексов не только подтверждает то, что нарушение гемокоагуляции у исследуемого больного действительно зависит от блокады волчаночным антикоагулянтом плазменных фосфолипидных мембран, но и позволяет количественно оценить степень этой блокады. В норме указанные индексы варьируют в пределах от 0.9 до 1.1, а у больных с АФС - существенно повышены. Соответствующие ядовые диагностикумы выпускаются в Российской Федерации фирмой "Технология-Стандарт" (Барнаул), за рубежом - фирмами "American diagnostica", "Loxo", "Stago" и др.

Некоторые виды АВТ, отличающиеся высокой  тромбогенностью [29], вызывают значительное замедление свертывания и в коагуляционном тесте с разведенным тканевым тромбопластином. Реагент разводится так, чтобы нормальное протромбиновое время было в пределах 45-55 с [2, 4, 13, 14, 17, 18]. Это определение также используется в комплексе диагностических тестов, выявляющих эффекты АВТ. Под влиянием АВТ протромбиновое время в плазме больного удлиняется по сравнению с эталонной нормальной плазмой в 1,2 раза и более. Однако нужно иметь в виду большое разнообразие выпускаемых разными фирмами тканевых тромбопластинов - получение их из разных исходных продуктов, неодинаковую чувствительность к действию АВТ и др. [2]. Поэтому в маркировках фирм-производителей должна быть указана возможность использования предлагаемого разведенного тромбопластина для определения антитромбопластиновой активности АВТ.