Папилломавирусная инфекция

 

Рис. 8. Изменение вирусной нагрузки HPV-16 при канцерогенезе, логарифмическая шкала.

 

Наиболее оптимальным методом для определения титра вируса признается ПЦР в режиме реального времени.

Однократное определение титра малоинформативно. По данным М. Cricca и соавторов (2007 г.) диапазон варьирования титра HPV-16 составляет: при ЦИН I - 2.40х101-2.74х106 копий ДНК на клетку; при ЦИН П/Ш - 1.25х103-1.49хЮ9; при карциноме - 3.54х102-2.60х104. Использование тестов по определению вирусной нагрузки высокоонкогенных ВПЧ в качестве маркеров высокого риска развития рака оправдано только в режиме мониторинга.

 

Определение полноразмерной мРНК генов е6 и е7 ВПЧ

Молекулярные механизмы канцерогенеза при ВПЧ-инфекции связаны с активностью онкогенов е6 и е7, кодирующих белки Е6 и Е7, соответственно. Об активности генов можно судить по интенсивности считывания с них генетической информации (транскрипции) в виде синтеза на матрице ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности генов, информационной или матричной РНК (мРНК).

Присутствие в клиническом материале полноразмерной мРНК генов е6 и е7 онкогенных ВПЧ ассоциировано с повышенным риском неопластической прогрессии (рис.9).

 

Рис. 9. Частота обнаружения ДНК и мРНК ВПЧ при цервикальной интраэпителиальной дисплазии.

 

Для выявления полноразмерной мРНК генов еб и е7 ВПЧ разработано несколько вариантов методов детекции: HPV OncoTect1M (Invirion Diagnostics LLC), PreTect™ HPV-Proofer (NorChip AS, Klokkarstua, Hurum, Norway), APTIMA® HPV assay (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA, USA).

HPV OncoTect -тест

HPV OncoTectTM – тест; является разработкой фирмы Invirion Diagnostics LLC. Этот тест позволяет с помощью проточной цитометрии выявлять мРНК генов е6 и е7 ВПЧ в инфицированных клетках. В отличие от ПЦР или ВПЧ Digene-теста, при которых инфицированные клетки разрушают для выделения ДНК вируса, при постановке HPV OncoTect-теста используют суспензии инфицированных неразрушенных клеток. Клетки получают из биопсийного материала или цитологических мазков. После подготовки клеточной суспензии, включающей флуоресцентное мечение поверхностных антигенов клеток (этап необходим для идентификации эпителиальных клеток при цитометрии), клетки фиксируют и обрабатывают специальным пермебиализирующим раствором (способствует проникновению реактивов внутрь клетки). Далее проводят гибридизацию со смесью олигонуклеотидных зондов, удаляют несвязавшиеся компоненты и анализируют образцы с помощью проточного цитометра (рис. 10).

 

Рис. 10. Положительный результат HPV OncoTect™ - теста

(из клинического протокола HPV OncoTect Test Kit, Invirion Diagnostics, 2006).

 

PreTect HPV-Proofer -тест

PreTect HPV-Proofer-тест - это вариант обнаружения полноразмерной мРНК генов е6 и е7 ВПЧ, разработанный фирмой NorChip. В 2007 году благодаря сотрудничеству фирмы NorChip и фирмы BioMerieux (Франция) появился полностью автоматизированный вариант постановки теста, который объединил технологию обнаружения мРНК ВПЧ, развитую и запатентованную NorChip и технологию NASBA в реальном времени от BioMerieux. NASBA (от англ. Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) или NASBA является разновидностью изотермической амплификации РНК. Метод был разработан в качестве альтернативы ПЦР и позволяет при постоянной температуре амплифицировать 109 - 1012 копий РНК за 60-90 минут. С помощью такого подхода можно одновременно выявлять мРНК нескольких типов ВПЧ из группы высокого онкогенного риска (HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-45). При необходимости количество типов ВПЧ может быть увеличено.

 

 

 

 

Определение состояния клеток, инфицированных ВПЧ

Методом ранней диагностики предраковых клеток и прогнозирования высокого риска развития рака при папилломавирусной инфекции является выявление маркеров озлокачествления клеток, инфицированных ВПЧ. Пример - тест на белок pl6INK4a.

 

Тест Cervatec™

Разработка фирмы «mtm laboratories AG», Германия - тест CervatecTM pl6INK4a ELISA представляет собой вариант иммуноферментного анализа, который позволяет выявлять белок pl6ink4a непосредственно в цитологических мазках.

Белок pl6INK4a, циклинзависимый ингибитор киназы, играет ключевую роль в pRB-опосредованном контроле перехода Gl-S-фаз жизненного цикла клетки (pRB-тумор-супрессирующий белок ретинобластомы). Гиперэкспрессия гена pl6ink4a происходит вследствие инактивации гена туморсупрессирующего белка pRB онкогенным белком Е7 ВПЧ. Белок pl6INK4a накапливается в клетках при выраженной дисплазии. Использование данного биомаркера для диагностики ЦИН помогает значительно снизить количество неясных цитологических мазков при скрининге и способствует более точной диагностике.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВАКЦИНАЦИЯ ПРОТИВ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

 

Профилактическая иммунизация против ВПЧ доказала высокую эффективность в клинических исследованиях и дает обоснованную надежду быть эффективным орудием  первичной профилактики рака шейки матки и другой ВПЧ ассоциированной патологии.

1. Иммунный механизм вакцинации против ВПЧ.

Между естественным иммунитетом к ВПЧ и индуцированным вакцинами существует значительная разница. Естественный иммунитет вызывает клеточный иммунный ответ, который приводит к рассасыванию генитальных кондилом и интраэпителиальных поражений низкой степени. У людей концентрация антител бывает низкой, у многих женщин сероконверсия не развивается. ВПЧ ограничивает свою пролиферацию в базальных кератиноцитах и завершает жизненный цикл в полностью дифференцированных клетках, находящихся в процессе естественного умирания. В результате, они не вызывают реакции иммунной системы с помощью воспаления или лизиса клеток хозяина и некоторое время могут от нее ускользать, особенно от представляющих антиген клеток Лангерганса.

В то время как ВПЧ при естественном инфицировании ускользает от иммунной системы, ВПЧ в виде вакцины являются доступными для иммунной системы и стимулируют здоровый иммунный ответ. В противоположность естественному, механизм защиты вакцины происходит за счет сывороточных антител. Поскольку вакцина вводится внутримышечно, находящиеся в вакцине вирусоподобные частицы быстро попадают в кровоток, что имитирует виремию. Антигены капсида обрабатываются и захватываются представляющими антиген клетками (АПК). Эти АПК переносят антигены в лимфатические узлы, где они активируют T-хелперы и косвенно B-клетки, вырабатывающие антитела. Вакцина стимулирует образование высоких концентраций антител, как минимум в 100 раз превышающих их концентрацию при естественном иммунитете. В клинических исследованиях сероконверсия развивалась практически у всех пациентов.

Хотя известно множество типов ВПЧ, только несколько из них вызывают большинство аногенитальных заболеваний. Низкоонкогенные типы 6 и 11 ответственны за > 90% всех аногенитальных кондилом у женщин и мужчин и постоянно определяются как этиологический фактор возвратного респираторного папилломатоза (RRP). ВПЧ 16-го и 18-го типов ответственны за, как минимум, 70% случаев рака шейки матки. ВПЧ-инфекция также тесно связана с раком вульвы и влагалища, а также раком ануса. ВПЧ 18-го типа часто ассоциируется с аденокарциномой шейки матки, которая плохо выявляется с помощью мазков из шейки матки.

Некоторые мужчины могут иметь анальные или генитальные поражения связанные с ВПЧ 16-го или 18-го типов, также у мужчин-потомков может развиваться RRP с ювенильным началом вследствие передачи материнского ВПЧ типов 6 и 11. Однако большинство мужчин служит «носителями» или «переносчиками» онкогенных ВПЧ. Партнеры-мужчины действительно могут вносить значительный вклад в риск развития рака шейки матки у своих партнеров-женщин. В мире проводятся исследования, расширяющие показания для применения квадривалентной вакцины у мужчин до 26 лет. Такие показания уже зарегистрированы в США.

Данные, полученные за 5 лет после введения вакцины свидетельствуют, что  антительный ответ на квадривалентную вакцину является продолжительным. У реципиентов наблюдался интенсивный иммунный ответ, указывающий на иммунологическую память в течении 5 лет после иммунизации. Женщины из стран Скандинавского региона, включенные в исследования фазы III по оценке эффективности, будут находиться под наблюдением как минимум в течение 10 лет с 2003 года. Это даст представление о долгосрочной безопасности и продолжительности эффективности вакцины за несколько лет до наблюдения за первыми вакцинированными после выпуска вакцины на рынок. Сейчас срок успешного международного наблюдения составляет 7 лет.

Поскольку большинство заболеваний связано с ВПЧ типов 6,11,16 и 18, квадривалентная вакцина, направленная на эти типы ВПЧ, как ожидается, значительно уменьшит ущерб, причиняемый заболеваниями, связанными с ВПЧ.

2. Международные данные по применению вакцинации.

В Европейском Союзе были получены лицензии на две вакцины против вируса папилломы человека (ВПЧ): на квадривалентную вакцину (Гардасил®) - в сентябре 2006 г., и бивалентную вакцину (Церварикс®)  - в сентябре 2007 г.. Обе вакцины показаны для профилактики, их цель предупредить предраковые поражения (CINII +) и раки вследствие персистирующей инфекции ВПЧ 16 и 18 типов у женщин, которые ранее не были инфицированы этими типами ВПЧ.

Квадривалентная вакцина также предупреждает инфицирование ВПЧ 6 и 11 типов, ответственными за 80-90% генитальных бородавок. Это вакцина, состоящая из вирусоподобных частиц (VLP) 6, 11, 16 и 18 типов ВПЧ. VLP получены путем экспрессии вирусных капсидных белков L1 в дрожжевых клетках  Saccharomyces cerevisiae, очищены и  адсорбированы в алюминиевом адъюванте- amorphous aluminum hydroxyphosphate sulfate.

Квадривалентная вакцина Гардасил зарегистрирована в 109 странах мира, в то числе в  Российской Федерации с 2006 года.

Согласно эпидемиологическим данным, ВПЧ - трансмиссия может случиться уже при первом половом контакте. Пик заболеваемости в большинстве популяций наблюдается в пределах 5-10 лет после сексуального дебюта (в возрасте 15-25 лет).  Принимая во внимание этот факт и тот, что вакцина против ВПЧ профилактическая и эффективна, если введена до воздействия вируса, ясно, что лучшая стратегия  - это вакцинация подростков и молодых женщин.

Исследования III фазы (FUTURE I и II), в которых участвовали около 15 000 женщин в возрасте 16-26 лет из Европы, Северной Америки, Азии и Латинской Америки, показали, что квадривалентная вакцина высоко эффективна в профилактике предраковых поражений - цервикальной, вульварной и вагинальной интраэпителиальной неоплазии, а также аденокарциомы in situ, ассоциированных с  ВПЧ 6, 11, 16 и 18, у женщин, наивных по отношению к этим типам при включении в исследование. Также была доказана высокая эффективность против генитальных кондилом, связанных с ВПЧ 6 и 11. Данные этих исследований показали, что женщины, наивные перед вакцинацией по отношению ко всем четырем вакцинным типам (серологически и ДНК негативные), получают от вакцинации полную пользу, т.е. защиту от заболеваний, вызванных всеми четырьмя типами. 

В то же время женщины, которые перед вакцинацией уже инфицированы одним или более вакцинными типами, получают частичную выгоду от вакцинации -  защиту от тех типов, с которыми они еще не встречались. На этом основании международные эксперты, помимо рутинной вакцинации подростков (первичная целевая популяция), рекомендуют массовую вакцинацию женщин до возраста 26 лет (дополнительная популяция), независимо от исходного ВПЧ статуса.

С возрастом риск  получения новой ВПЧ инфекции  снижается, но этот риск остается существенным на протяжении всей сексуально активной жизни женщины.   Второй пик распространенности был зафиксирован у женщин в четвертой и пятой декадах их жизни.

Эпидемиологический анализ демонстрирует, что  возрастная распространенность ВПЧ неодинакова в различных регионах мира. Результаты мета-анализа 78 опубликованных исследований, включавших 157 879 женщин с нормальными цитологическими мазками, согласуются с вышеизложенными данными. В Европе, Африке и Америке, второй пик распространенности вируса папилломы человека наблюдается у женщин 45 лет и старше.

Наряду с этим, женщины среднего возраста продолжают приобретать и клинически развивать доброкачественные ВПЧ-инфекции. Хотя наиболее часто генитальные кондиломы появляются в возрасте 20-24 лет, риск их возникновения  остается существенным и после 30.

Таким образом, женщины старше 25 лет остаются в зоне риска новых ВПЧ инфекций/заболеваний, а значит, они могут получить пользу от профилактической вакцинации. В мире завершены клинические исследования у женщин среднего возраста подтверждающие роль квадривалентной вакцины в предупреждении персистирующей инфекции и заболеваний, ассоциированных с 6/11/16/18 типами ВПЧ в популяции женщин 24-45 лет.

Квадривалентная вакцина продемонстрировала в международных исследованиях

- имеет  98% эффективность при CIN 2/3 и AIS, вызванных ВПЧ 16/18 типов и 100% эффективность при AIS, вызванной ВПЧ 16/18 типов

- имеет высокую эффективность при вызванных ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов наружных генитальных поражениях (остроконечных кондиломах, VIN, VaIN)

-перекрестную защиту против 10 дополнительных типов ВПЧ, вызывающих цервикальный рак и ответственных за  >20% наблюдающихся цервикальных раков.

- демонстрирует сильный иммунный ответ, указывающий на наличие иммунной памяти при стимуляции антигеном через 5 лет

- безопасна в применении

 

Применение Квадривалентной вакцины  рекомендовано:

- Всемирной  Организацией Здравоохранения  с 2006 г.,

- Американской  коллегией акушеров-гинекологов,

- Обществом  медицины подросткового возраста,

- Экспертным  советом по лекарственным средствам  Австралии с 2006 г.

Вакцина  зарегистрирована в 117 странах мира.

Вакцинация квадривалентной вакциной включена в национальные календари для девочек следующих стран: Канада, США, Бельгия, Франция, Испания, Лихтенштейн, Греция, Дания, Австралия, Словакия, Израиль.

В Алжире, Кипре, Новой Зеландии, Австрии, Гренландии, Нидерландах прививают и девочек, и мальчиков.