Питательные среды

 

Весьма важную питательную среду для бактерий представляет кровяная сыворотка.  Представляя собой прозрачный, плотный субстрат, приготовляемый из крови, она по составу своему лучше других сред удовлетворяет разнообразным требованиям, предъявляемым многими живущими в человеческом и животном организме болезнетворными микроорганизмами (палочкой дифтерита, туберкулеза и др.). Добывание крови для приготовления сыворотки и стерилизация последней связаны с немалыми затруднениями. Рациональнее всего пользоваться способом Ру и Нокорда, при котором в момент взятия крови исключается попадание зародышей из воздуха, чем устраняется необходимость стерилизации субстрата. В яремную вену животного вкалывается при соблюдении антисептических предосторожностей троакар; вынув из него иглу, вставляют стеклянную трубку, нижним своим концом переходящую через ватную пробку в узкий, высокий, тщательно обеспложенный цилиндр, собирающий кровь. Последняя оставляется в прохладном месте на 48 часов; отстоявшаяся за это время совершенно прозрачная, янтарно-желтого цвета сыворотка снимается обеспложенными пипетками в обеспложенные пробирки; последние кладут затем в особый термостат, дно которого слегка наклонено, и сыворотка без предварительной стерилизации подвергается здесь в косом положении свертыванию в течение 30-60 минут при 68°. Свертывание производится при косом положении пробирки с целью образования сывороткой по ее оплотнении широкой поверхности. Этот точный способ доступен лишь в лабораториях, имеющих в своем распоряжении какое-либо крупное животное (лучше всего лошадь), могущее дать время от времени большое количество крови (из 1-1,5 литров получается не больше 100-200 куб. см сыворотки). Обыкновенно приходится брать кровь на бойне и полученную через 2 дня сыворотку подвергать предварительно обеспложиванию по Тиндалю, нагреванием 8 дней подряд по 1 часу при 58°. Быстрое однократное обеспложивание сыворотки при высокой температуре невозможно: уже при темп., не превышающей 70°, она становится негодной, превращаясь в грязно-серую, мутную, непрозрачную массу. Если кровяная сыворотка не предназначена для немедленного употребления, то, по Кох-Кирхнеру, для ее стерилизации пользуются хлороформом, который, будучи прибавлен в количестве 1 куб. см на 100 куб. см сыворотки, в течение 2 месяцев вполне ее обеспложивает. Колбочки с содержимым во избежание испарения хлороформа тщательно закупориваются резиновыми пробками, которые заливаются парафином. В этом виде сыворотка сохраняется неограниченно долгое время.

 

При необходимости пользования ею резиновые пробки заменяются обеспложенными ватными пробками, и колбочки ставятся на несколько дней в термостат для испарения хлороформа; сыворотка, разлитая затем в обеспложенные пробирки, подвергается обычным путем свертыванию. Баранья или телячья кровяная сыворотка, смешанная, по Лёффлеру, в отношении 3: 1 с телячьим бульоном, содержащим 1% пептона, 1% виноградного сахара и 0,5% поваренной соли, представляет лучшую питательную среду для дифтерийной палочки; размазав на поверхности этого субстрата подозрительную пленку, снятую с зева, можно в случае дифтерита уже нередко через 6 часов поставить диагностику, а следовательно, своевременно приступить к лечению противодифтерийной сывороткой. В некоторых специальных случаях, особенно для открытия гонококков, пользуются человеческой сывороткой, добывая кровь во время родов из последа. После перевязки и перерезки пуповины плацентарный ее конец, предварительно обмытый сулемой и стерилизованной водой, опускают в обезвоженную колбу, куда благодаря продолжающимся сокращениям матки выгоняется из пуповины небольшое количество крови. С целью воспользоваться кровяной сывороткой (которая, будучи раз свернута, более уже не разжижается) и для пластинчатых разводок, т.е. для изоляции бактерий, заражают жидкую обеспложенную, но несвернутую сыворотку прививным материалом и тщательно смешивают ее с 2% растопленным и остуженным до 42° С агаром; смесь разливается затем в чашки Петри, где она и застывает.

 

Глава1.4.Непрозрачные питательные среды

 

Из непрозрачных питательных сред первое место занимает картофель. Он служит прекрасным субстратом для многих сапрофитов и патогенных бактерий, обнаруживающих на нем характерный типический рост; им пользуются также для сохранения разводок на продолжительный срок и для обнаружения микроорганизмом спорообразования. Крупные, так называемые салатные картофелины очищаются под струей воды от грязи, после чего кончиком картофельного ножа вырезают все подозрительные места (глазки), разрезают картофель на круглые пластинки, кладут их в маленькие двойные чашки и обеспложивают в коховском аппарате. Рациональнее еще пользоваться для разводок на картофеле широкими, в 2,5 см в диаметре, пробирками. Пробочным сверлом вырезают из крупного картофеля цилиндр, разрезают его по диагонали на два клина и вкладывают каждый из них в пробирку широким концом вниз. Для предохранения разводки от загрязнения конденсационной водой, выделяющейся из картофеля, практично пользоваться пробирками, имеющими недалеко от дна кольцеобразное сужение, на котором и покоится картофельный клин, вода же собирается на дно пробирки, ниже сужения. Перед опусканием картофеля в пробирку наливают в последнюю несколько капель воды для предохранения субстрата от высыхания.

Для пигментных бактерий пользуются, по Сойка и Кралю, питательной средой, приготовленной из разваренного в молоке риса: 100 г рисовой муки, тщательно растертой в ступке с 250 куб. см снятого молока, разваривают при постоянном помешивании в густую кашу и туго набивают последней цилиндрическую трубку. По охлаждении выдавливают рисовый цилиндр из трубки, разрезают его на несколько параллельных дисков, укладывают каждый из них в отдельную чашку, куда наливают еще несколько капель молока, и обеспложивают в течение 1/2 часа в коховском аппарате. На ярком фоне этой среды разноцветные пигментные бактерии выступают очень резко.

Хлебная мезга, обладая кислой реакцией, служит хорошей средой для плесневых грибов. Насыпают в эрленмейеровские колбы обыкновенный черный хлеб, высушенный и растертый в мелкий порошок, прибавляют воды до получения однообразной влажной каши и обезвоживают в паровом котле.

 

 

Глава 2.Приготовление сред

 

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 мин в 1—2% растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде. (Посудой, предназначенной для приготовления сред, нельзя пользоваться в других целях, например для хранения химических реактивов или дезинфицирующих растворов — даже следы этих веществ могут помещать росту микроорганизмов.)

 

Исходным сырьем для приготовления большинства сред служат продукты животного или растительного происхождения: мясо и его заменители, молоко, яйца, картофель, соя, кукуруза, дрожжи и др.

 

Основные питательные бульоны готовят на мясной воде или на различных переварах, полученных при кислотном или ферментативном гидролизе исходного сырья. Бульоны из переваров в 5—10 раз экономичнее, чем из мясной воды. Среды на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее; обладают большей буферностью, т. е. имеют более стабильную величину рН. Кроме того, препараты можно готовить из заменителей мяса (сгустков крови, плаценты, казеина и т. д.).

 

В настоящее время снабжение лабораторий мясной водой и переварами централизовано. Чаще пользуются панкреатическим переваром Хоттингера, гидролизатами казеина или кормовых дрожжей. Из этих полуфабрикатов, по определенным рецептам, готовят необходимые среды.

Этапы приготовления сред: 1)варка; 2) установление оптимальной величины рН; 3) осветление; 4) фильтрация; 5) разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.

 

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

 

Установление рН сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рН используют потенциометр.

 

Разливают среды в пробирки (по 3—5 мл или по 10 мл), флаконы, колбы, матрицы и бутылки не более чем на 23 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность.

 

Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100°С, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно разли вают в стерильную посуду.

 

Разливают среды с помощью воронки, на конец которой* надета резиновая трубка с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы-пипетки и т. п.

 

Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и датой ее приготовления.

 

Стерилизация. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в ее рецепте.

 

Контроль готовых сред: а) для контроля стерильности среды ставят в термостат на 2 сут, после чего просматривают. Если на средах не появятся признаки роста, их считают стерильными и передают для химического контроля по не скольку образцов каждой серии; б) химический контроль: окончательно устанавливают рН, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно соответствовать указанному в рецепте).

 

Химический контроль сред производят в химической лаборатории; в) для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных (ростовых) свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контроля и др.

 

Хранят среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Некоторые среды, например, среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.

 

 

Глава 3.Методы посевов

 

Посев из пробирки в пробирку. Пробирку с посевным материалом и пробирку со средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне, а их основания находились поверх кисти. Обычно пробирку с посевным материалом держат ближе к себе. В правой руке, как писчее перо, держат бактериальную петлю, и стерилизуют ее, держа вертикально в пламени горелки. Мизинцем и краем ладони правой руки вынимают обе пробки одновременно. Извлекают пробки не рывком, а плавно - легкими винтовыми движениями. Вынув пробки, края пробирок обжигают в пламени горелки. Прокаленную петлю вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом, охлаждают и, набрав немного материала, осторожно переносят в пробирку со средой.

 

При посеве в жидкую среду посевной материал растирают на стенке пробирки над жидкостью и смывают средой.

 

При посеве на жидкие среды тампоном его погружают в среду и 3-5 с ополаскивают в ней. При посеве на плотную среду материал втирают в ее поверхность, вращая тампон, после чего тампон обеззараживают (помещают в пробирку, в которой он был доставлен в лабораторию, и автоклавируют).

 

При посеве на скошенный агар материал обычно растирают на поверхности среды зигзагообразными движениями снизу вверх, начиная от границы конденсата.

 

При посеве на плотные среды, разлитые в пробирки столбиком, петлей с посевным материалом прокалывают столбик, производя так называемый посев "уколом".

 

После посева петлю извлекают из пробирки, края пробирок обжигают и, проведя пробки через пламя горелки, закрывают пробирки, после чего прокаливают петлю.

 

Посев жидкого материала можно производить стерильными пипетками (пастеровскими или градуированными). После посева пипетки погружают в дезинфицирующую жидкость.

 

Посевы во флаконы, матрацы и бутыли производят примерно так, как в пробирки, только сначала набирают материал (петлей или в пипетку), а потом открывают сосуд со средой.

 

Сосуды с засеянной культурой надписывают и ставят в термостат.

 

Посев на пробирки с чашки Петри. Изучив характер роста культуры на чашке, со стороны дна отмечают восковым карандашом нужный для посева участок. Чашку с посевным материалом ставят перед собой крышкой вверх. Левой рукой приоткрывают крышку и вводят под нее обожженную петлю. Остудив петлю, набирают посевной, материал с отмеченного участка. Вынимают петлю, закрывают чашку и в левую руку берут пробирку со средой. Посев производят так же, как с пробирки в пробирку. После посева чашку поворачивают вверх дном.

 

Посев на агар в чашки Петри. Посев шпателем. Шпатель - это стеклянная или металлическая трубочка, конец которой загнут в виде треугольника. Шпатель можно сделать из пастеровской пипетки, согнув под углом ее тонкий конец, предварительно разогретый в пламени горелки.

 

Левой рукой слегка приоткрывают крышку, держа ее большим и указательным пальцем. Петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность среды посевной материал, после чего тщательно втирают его круговыми движениями шпателя до тех пор, пока шпатель не перестанет свободно скользить по поверхности среды, левой рукой при этом придерживают крышку и одновременно вращают чашку. По окончании посева шпатель вынимают из чашки и закрывают крышку. Стеклянный шпатель помещают в дезинфицирующий раствор, а металлический прокаливают в пламени горелки.

 

Посев петлей. Небольшое количество посевного материала (иногда его предварительно эмульгируют в стерильном изотоническом растворе или бульоне) втирают петлей в поверхность среды у края чашки, несколько раз проводя петлей из стороны в сторону. Затем у того места, где закончились штрихи, агар прокалывают петлей, снимая избыток посевного материала. Оставшийся на петле посевной материал зигзагообразными движениями распределяют по всей поверхности среды. По окончании посева закрывают чашку и прожигают петлю.

 

Посев петлей на секторы. Чашку со стороны дна расчерчивают на секторы. Посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру. Необходимо следить, чтобы штрихи не заходили на соседний сектор.

 

Посев тампоном. Тампон с посевным материалом вносят в слегка приоткрытую чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, вращая при этом тампон и чашку.

 

Посев газоном. Примерно 1 мл (20 капель) жидкой культуры (если культура с плотной среды, ее эмульгируют в стерильном изотоническом растворе или бульоне) наносят на поверхность агара и тщательно распределяют жидкость по поверхности среды. Чашку слегка наклоняют и пипеткой отсасывают избыток культуры, выливая ее в дезинфицирующий раствор. Туда же помещают пипетку.

 

Посев в толщу агара. Культуру, выращенную на жидкой среде, или эмульгированный материал вносят в сосуд с расплавленным и остуженным до 45° С агаром, перемешивают и выливают в стерильную чашку Петри. Можно внести посевной материал в пустую чашку и залить 15-20 мл остуженного до 45° С агара. Для перемешивания содержимого чашки ее слегка покачивают и вращают. Чашки оставляют на столе до застывания среды.