Принципы лечения наследственных заболеваний. Симптоматическое, патогенетическое, этиологическое лечение. Адаптивная среда как метод леч

Первые успешные опыты  по генотерапии наследственных заболеваний проведены в 1990 г. в США. Они были направлены на коррекцию генетического дефекта при тяжелом комбинированном иммунодефиците, обусловленном мутацией в гене аденозиндезаминазы. Снижение активности этого фермента приводит к выраженному подавлению иммунного ответа в результате накопления в организме дезоксиаденозина, оказывающего токсическое действие на Т- и В-лимфоциты, Введение двум больным с этим тяжелым заболеванием нормальной копии гена с Т-лимфоцитами или стволовыми клетками костного мозга привело к практически полной компенсации иммунодефицита. На сегодняшний день проведено уже более 600 клинических испытаний по генотерапии ряда моногенных и онкологических заболеваний человека. Однако до настоящего времени генотерапевтическая коррекция наследственных дефектов не нашла широкого применения в клинической практике. Это связано прежде всего с проблемой доставки генетического материала и невозможностью существующими методами добиться стабильной экспрессии трансдуцированного гена в клетках и тканях больного.

В настоящее время исследования по генотерапии в основном направлены на коррекцию генетических дефектов соматических, а не половых клеток, что связано с чисто техническими проблемами, а также из соображений безопасности.

Разрабатываются три основные подхода к коррекции генетических дефектов посредством генотерапии:

1) компенсация  экспрессии функционально неактивных  аллелей введением в клетку  дополнительных копий гена;

2) угнетение  избыточной экспрессии гена;

3) усиление иммунного  ответа организма. 

Первый подход основан на введении в определенные клетки и ткани организма дополнительного генетического материала, корригирующего нарушение экспрессии одного или нескольких мутантных генов. Этот подход наиболее часто используют для коррекции генетического дефекта при моногенных и некоторых мультифакториальных заболеваниях. Коррекция генетического дефекта осуществляется как в половых, так и в соматических клетках организма. Более предпочтительна генотерапия на уровне соматических клеток, так как она позволяет модифицировать экспрессию генов в определенном типе клеток и тканей и не приводит к передаче измененной генетической информации в ряду поколений.

Второй подход основан на подавлении избыточной функции генов и их продуктов в клетках. Этот подход чрезвычайно перспективен для лечения онкологических заболеваний. В этом случае используют несколько генотерапевтических методов:

1) введение генов,  продукты которых приводят к  гибели избыточно пролиферирующих  клеток (генов-убийц);

2) блокирование  экспрессии онкогенов путем введения  антисмысловых нуклеотидных последовательностей или генов, продукты экспрессии которых являются антителами для ряда белковых продуктов опухолевой клетки;

3) введение в  опухолевые клетки нормальных  копий генов-супрессоров.

Третий подход направлен на повышение иммунореактивности клеток-мишеней или активации иммунной системы организма и разрабатывается для онкологических и вирусных заболеваний.

Рассмотрим  более подробно использование этих трех способов генотерапии.

Коррекцию функции мутантных генов и восстановление их экспрессии можно осуществить двумя путями: I) заменой мутантного гена его нормальной копией; 2) введением нормальной копии гена при сохранности мутантной. Наиболее часто применяют второй подход генотерапевтической коррекции наследственных дефектов, что обусловлено техническими трудностями, возникающими как при удалении мутантного аллеля, так и при последующем встраивании его нормальной копии.

Разрабатываются два основных способа доставки генов  в соматические клетки человека —  in vitro и in vivo.

Первый способ предполагает перенос генов в  культуру клеток человека, после чего трансдуцированные клетки вводятся в организм хозяина. При втором способе доставка нормального гена осуществляется непосредственно в организм человека. Используются два основных способа доставки генетического материала в клетки человека: прямой перенос некомпактизированной («голой») плазмидной ДНК, свободной от белков, с которыми она обычно связана в хромосомах, и доставка генных конструкций с помощью векторных систем.

Для прямого переноса генетического материала в клетку используют флуоресцентно-меченную плазмидную ДНК, методику гидродинамического шока, насыщение ДНК полианионом (гепарином, декстран-сульфатом), а также ряд физических способов доставки ДНК. Среди физических методов доставки генетических конструкций в организм человека: электропорация, баллистическая трансфекция («генное ружье») и безигольное введение (бомбардировка клеток молекулами ДНК, связанными с различными металлами - Аu+, Са++).

В качестве векторных  систем могут быть использованы некоторые  вирусы, липосомы (липидные пузырьки с включенными в них фрагментами ДН К) и катионные полимеры (полиэтиленамин, полилизин, лизин-гистидиновый полимер). Наиболее перспективными при проведении генотерапии считаются вирусные векторные системы, содержащие человеческий ген, встроенный в определенный участок генома вируса. Более чем в 80% всех генотерапевтических испытаний для доставки генетического материала были использованы именно вирусные векторы.

Известно, что  вирусы легко проникают в клетку, взаимодействуя с белками мембраны и клеточными рецепторами, и могут  интегрироваться в ядерный геном. Наличие специфического набора поверхностных  белков позволяет различным вирусам  внедряться в определенный тип клеток, осуществляя тканеспецифическую экспрессию гена. Наиболее часто в качестве векторных систем используются аденовирусы, ретровирусы и лентивирусы, которые различаются по ряду характеристик:

1) способности трансфекции пролиферирующих и непролиферирующих клеток;  
2) способности интеграции в геном хозяина и, следовательно, длительности и направленности экспрессии;  
3) уровню иммуногенности (степени иммунного ответа на введение векторной системы);  
4) степени риска возникновения инсерционных мутаций;  
5) пакующей способности вектора, определяющей размер генетического материала, который может быть введен в вектор.

Необходимо  отметить, что не существует универсального носителя, который обеспечил бы эффективную доставку генетического материала при всех наследственных заболеваниях. В последние годы рассматривается возможность создания невирусных носителей, представляющих собой мультифункциональные самособирающиеся комплексы с ДНК, в которых каждый компонент имеет определенную функцию по преодолению различных барьеров в организме человека.

Среди новых  перспективных подходов к коррекционной генотерапии следует отметить метод химеропластики, основанный на генной конверсии в клетках, полученных от больного. Показано, что при добавлении в культуру делящихся клеток различных фрагментов геномной ДНК (химеропластов) можно добиться их гомологичной рекомбинации с нативной ДНК. В состав химеропластов входят короткие цепочки ДНК (около 25 нуклеотидов) и комплементарные им цепочки РНК. При этом в последовательность ДНК/РНК шпилечной структуры включается основание, по которому планируется замена. Замещение нужного кодона в структуре ДНК (конверсия) в клетках мишенях происходит достаточно эффективно и обнаруживается в 25%-40% клеток in vitro. После осуществления химеропластики клетки мишени возвращаются в организм больного.

Возможно, также  проводить замену не всего гена, а только некоторых его экзонов, несущих мутацию. Этот метод получил название метода перепрыгивания экзонов (exon-skipping). Его суть состоит в возникновении гибридизации in vitro в культуре клеток больного его ДНК с короткими антисмысловыми последовательностями РНК, комплементарных местам сплайсинга первичного РНК-транскрипта. Это, в свою очередь, приводит к проскальзыванию петли сплайсинга и удалению из мРНК мутантных экзонов,

В последние  годы разрабатывается еще один, принципиально  новый подход к коррекции генетического дефекта при моногенных заболеваниях. Он основан на специфической активации нормальных генов, являющихся гомологами мутантных генов, путем введения химических стимуляторов. Этот подход наиболее интенсивно разрабатывается при двух заболеваниях - прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшена/Бекера и серновидноклеточной анемии. При прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера активируют ген белка утрофина, локализованный на хромосоме 6q24. Показано, что этот ген, подобно гену дистрофина, экспрессируется в мышцах, мозге и висцеральных тканях и его продукт – утрофин - способен взаимодействовать с белками дистрофин-ассоциированного комплекса в раннем эмбриогенезе. Возможно, утрофин представляет собой фетальную изоформу дистрофина и его ген можно рассматривать как аутосомный гомолог гена дистрофина. В опытах на утрофин/дистрофин дефицитных линиях трансгенных мышей показано, что введение им укороченной формы утрофина приводит к восстановлению функций дистрофин-ассоциированного комплекса белков и коррекции основных миопатических симптомов.

При онкологических заболеваниях наиболее часто используются генотерапевтические подходы, направленные на прекращение или резкое снижение репликации ДНК опухолевой клетки, подавление экспрессии онкогенов или введение генов-супрессоров (например, ТР53). Снижения синтеза ДНК в опухолевой клетке можно добиться путем введения генов, экспреосирующих ферменты, которые тормозят репликацию ДНК. Один из таких ферментов-тимидинкиназа вируса простого герпеса. Тимидинкиназа фосфорилирует ганцикловир, превращая его в ганцикловир-трифосфат, который способен встроиться в нуклеотидную последовательность ДНК, терминируя ее синтез и приводя к гибели делящейся опухолевой клетки.

Блокирование экспрессии онкогенов может осуществляться двумя путями: введением антисмысловых нуклеотидных последовательностей, связывающих мРНК онкогенов, или генов, кодирующих антитела к мутантному белку,

Большое количество попыток генотерапии опухолевых заболеваний основаны на стимуляции иммунной системы целого организма и повышении иммуннореактивности самих опухолевых клеток. Активация иммунного ответа организма может быть достигнута при помощи введения генов, продукты которых являются стимуляторами иммунитета, например цитокинами. Повышения иммуннореактивности опухолевых клеток можно добиться и введением в биоптат опухолевых клеток больного генов-белков иммунностимуляторов (интерлейкинов, интерферона, фактора некроза опухолей и др,) in vitro. Трансформированные таким образом высоко иммунногенные и инактивированные путем облучения опухолевые клетки вводят, как вакцину, в организм больного.

Таким образом, из разработанных современных методов лечения наследственных заболеваний человека генотерапия представляется наиболее перспективным при условии решения всех вышеперечисленных проблем.

Наряду с  генноинженерными подходами к коррекции генетического дефекта разрабатывается еще одно направление в лечении наследственных болезней, получившее название клеточная терапия. Суть метода заключается во введении в пораженную ткань клеток-предшественников, полученных от здорового донора. Наиболее интенсивно это направление разрабатывается при лечении наследственных миопатий, прежде всего, прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера. Известно, что мышцы человека в постнатальном периоде состоят из многоядерных клеток — миофибрилл, которые в процессе онтогенеза формируются из одноядерных миобластов путем их слияния. Миобласты в небольших количествах присутствуют в скелетной мускулатуре взрослого человека. Выделенные из биоптатов здоровых доноров и культивированные миобласты сохраняют способность к слиянию с многоядерными миофибриллами. Показано, что при трансплантации культивированных миобластов в мышечную ткань больного ПМДД/Б происходит внедрение ядра донорского миобласта в миофибриллу больного, в результате чего индуцируется экспрессия нормального генадистрофина. К недостаткам этого метода следует отнести кратковременную экспрессию генов ядер донорской клетки и трудности получения неиммуногенной чистой культуры миобластов.

Новые методы лечения  наследственных заболеваний

Искусственные хромосомы для лечения наследственных заболеваний

Специалистам Центра конструирования  хромосом (иректор центра, профессор Митсуо Ошимура) при Университете Тоттори в Японии удалось создать искусственные хромосомы человека для генной и клеточной терапии наследственных заболеваний. Заявлено (22 мая 2012 г.) о возможности лечения миодистрофии Дюшена - прогрессирующего заболевания нервно-мышечного аппарата, характеризующегося дегенеративными изменениями в мышечных волокнах. Проведенные М. Ошимурой исследования на мышах показали, что генная терапия с использованием искусственных хромосом позволяет нормализовать работу мускулатуры животных. Суть методики профессора заключается в создании хромосомы, несущей фрагмент ДНК без мутации. Хромосома помещается в стволовую клетку, которая в данной ситуации выступает как транспортное средство для корректирующего гена. В процессе последующего культивирования получаются клетки, трансплантацией которых можно восстановить органы и ткани, работа которых нарушена наследственными заболеваниями.