Производство лекарственных средств, нормализующих микрофлору кишечника

Министерство образования  и науки Российской Федерации

федеральное государственное  бюджетное образовательное учреждение

высшего  профессионального  образования

«Пермский национальный исследовательский 

политехнический университет»

 

 

Факультет           Химико-технологический

Кафедра «Химия и  биотехнология»

Направление:   240700.68 «Биотехнология»

Магистерская программа: «Промышленная биотехнология и  биоинженерия»

 

Курсовая работа по промышленной биотехнологии:

Производство  лекарственных средств, нормализующих  микрофлору кишечника.

 

Проверила: Виноградова А.В.

Выполнила ст. гр. БТм2-12

Федорова М.С.

 

 

Пермь,  2013

Содержание

Введение……………………………………………………………………3

1. Препараты, улучшающие микрофлору кишечника……………………...4
2. Производство пробиотиков………………………………………………..7
3. Теоретический расчет…………………………………………………….11

4. Унификация технологии  пробиотиков…………………………………...12

Заключение………………………………………………………………..16

Список литературы……………………………………………………….17

 

Введение

Положительная роль нормальной микрофлоры кишечника человека велика. Аутофлора кишечника стимулирует  созревание механизмов общего и местного иммунитета. В процессе ее жизнедеятельности  образуются молочная, уксусная, муравьиная, пропионовая, масляная кислоты, способствующие подкислению внутрикишечного содержимого  и препятствующие размножению патогенных и условно патогенных бактерий в  кишечнике. Синтезируемые кишечной аутофлорой антибиотические вещества (колицины, лактолин, стрептоцид, низин, лизоцим) оказывают бактерицидное  или бактериостатическое воздействие  на болезнетворные микроорганизмы.

Состав микрофлоры в биопленке  кишечника может изменяться под  воздействием различных факторов. Если эти факторы, прямо или опосредованно  влияющие на фиксацию, выживание и  функционирование нормальной микрофлоры кишечника, превышают механизмы  защиты организма, они провоцируют  развитие дисбиоза кишечника. Наиболее выраженное отрицательное влияние на нормальную микрофлору кишечника оказывают антибиотики. Данные препараты в большинстве своём неспецифичны, поэтому оказывают губительное воздействие, как на болезнетворные микробы, так и нормальную микрофлору кишечника.

В начале XX столетия великий  русский ученый Мечников И.И. выдвинул гипотезу о том, что высокое содержание лактобацилл в кишечном биоценозе  является необходимым условием здоровья и долголетия человека. Мечников И.И. проводил опыты по использованию  в лечебных целях живой культуры бифидобактерий.

В последующие годы продолжались разработки лекарственных препаратов на основе микроорганизмов, обладающих полезными свойствами, – так называемых пробиотиков.

 

1. Препараты, улучшающие микрофлору кишечника

Пребиотики  – это препараты немикробного происхождения, способные оказывать  позитивный эффект на организм хозяина  через селективную стимуляцию роста  или метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника, стимулирующие  рост и размножение так называемых дружественных человеку бактерий. Это  низкомолекулярные углеводы (фруктозо-олисахариды, инулин, лактулоза и др.), которые  не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами [7].

Основные  известные препараты:

- лактулоза  – синтетический дисахарид. Микрофлора  толстой кишки гидролизует лактулозу  до молочной (в основном) и частично  до муравьиной и уксусной кислот. Она способствует понижению рН  содержимого толстого кишечника,  снижению концентрации гнилостных  бактерий, стимулирует перистальтику  кишечника и усиливает рост  бифидо- и лактобактерий;

- кальция  пантотенат участвует в процессах  ацетилирования и окисления в  клетках, углеводном и жировом  обменах, синтезе ацетилхолина, стимулирует  образование кортикостероидов в  коре надпочечников;

- лизоцим  способствует нормализации нарушений  микрофлоры. наиболее активен в  отношении грамположительных патогенных  и условнопатогенных бактерий. Лизоцим  обладает бифидогенным, имунномоделирующим, противовоспалительным действием,  улучшает пищеварение, стимулирует  метаболические процессы и эритропоэ,  проявляет синергизм со многими  антибиотиками.

Симбиотики  – комплексные препараты, содержащие пробиотик и пребиотик [4].

Пробиотики – это препараты нормальной микрофлоры человека. Пробиотики имеют в своем составе живые клетки специально подобранных штаммов микроорганизмов растительного или животного происхождения; они выживают в условиях кишечного окружения, непатогенны, нетоксичны, стабильны в течение длительного срока хранения.

Механизм  положительного влияния пробиотиков  включает:

- подавление  микробных патогенов за счет  продукции антибактериальных веществ,  конкуренции за лимитируемые  питательные вещества и сайты  адгезии на кишечной стенке;

- влияние  на ферментативную активность  кишечных микроорганизмов;

- стимуляцию  иммунной системы макроорганизма.

В России производят в основном моновалентные  препараты: бифидумбактерин (на основе Bifidobacterium bifidum), апилак (на основе Lactobacillis acidophillus), колибактерин (на основе кишечной палочки E. Coli M-17), лактобактерин (на основе Lactobacillus plantarum, fermentum). комплексные препараты, например бификол (Bifidobacterium и E. Coli M -17). За рубежом производя поливалентные (комплексные) препараты: симбиофтор, бификор, примадофилюс (содержит комплекс микроорганизмов  симбионтов) и другие.

Они предназначены  в основном для профилактики и  лечения дисбактериоза. Особенно широко применяют в клинике детских  болезней (при острой дизентерии, сальмонеллезе, эшерехиозе, вирусных диареях, диатезе  и др.). При несформировавшейся микроэкологической системы ЖКТ у детей применение препаратов пробиотиков оказывается  очень эффективным.

Препараты пробиотиков также применяют  в комплексном лечении кишечных инфекций, энероколитах на фоне нарушения  микрофлоры с дефицитом или полным отсутствием бифидофлоры и др.).

Пробиотики  также назначаются ослабленным  людям после соматических заболеваний  и по завершении лечения антибиотиками, лицам преклонного возраста, так  как у них в связи с изменением гормонального статуса уменьшается  количество бифидо- и лактобактерий.

Действующим началом лактосодержащих препаратов являются живые лактобациллы, обладающие антагонистическим действием против широкого спектра патогенных и условнопатогенных  бактерий за счет продукции кислот, перекиси водорода, лизоцима и антибиотическихвеществ. локтобациллы выделяют ферменты, витамины, способствуют пищеварению, улучшают обмен  веществ, обладают иммуномоделирующим действием, нормализуя естественную резистентность организма. Лактосодержащие препараты  целесообразно назначать детям  и взрослым при лечении ОКИ, хрогических  заболеваниях ЖКТ с выраженными  дисбиотическими явлениями, особенно в случае дефицита лактофлоры или  при использовании этих препаратов в комбинированной терапии с  антибиотиками [5].

К лактосодержащим  препаратам относится лактобактерин, апилакт, аципол, линекс, гастрофарм, биобактон.

Среди колисодержащих препаратов следует отметить колибактерин, лечебное действие которого обусловлено  антагонистической активностью  кишечной палочки в отношении  патогенных и условнопатогенных  микроорганизмов, включая шингеллы, сальмонеллы, протей и др., бификол  и бифилор.

Препараты из апатогенных представителей других таксономических групп или микробных  метаболитов. В этой группе относятся  препараты из апатогенных представителей родов Bacillus, Aerococcus и Saccharomyces. Из спорообразующих  бацилл готовят препараты бактисубтил, споробактерин, бактиспорин и биоспорин. Лечебное свойство споровых препаратов обусловлено их выраженными антагонистическими свойствами против широкого спектра  патогенных и условнопатогенных  бактерий, в том числе протеев, стафилококков и грибов рода Candida. Эти препараты содержат комплекс ферментов, стимулирующих пищеварение, способствуют лучшему усвоению пищи, содержат протеолитические и фибринолитические  ферменты, чем способствуют очищению воспалительных очагов от некротических  тканей. Наиболее известный представитель  этой группы – это препарат Хилак-форте. Он содержит концентрат продуктов метаболизма  бактерий тонкой и толстой кишки, в том числе метаболиты Lactobacillus acidophilus, L.helveticus, E-coli, Enterococcus faecalis, молочную и фосфорную кислоты, аминокислоты и другие вещества, способствущие  нормализации рН, восстановлению водно-электролитного баланса, состава нормофлоры и поддержанию  физиологической функции слизистой  оболочки кишечника.

 

2. Производство пробиотиков

В общем, производство пробиотиков  описывается нижеприведенной  схемой:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1. Схема производства пробиотиков

 

Технологию производства пробиотиков рассмотрим на примере  препарата Бифидумбактерин. Бифидумбактерин  представляет собой лиофилизированную  микробную массу живых бифидобактерий. Бифидумбактерин предназначен для  лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней у человека и животных.

По внешнему виду препарат представляет собой кристаллическую  или пористую массу бежевого или  беловато-серого цвета. В состав препарата  входят сахароза и желатин, которые  являются компонентами стабилизирующей  среды высушивания. Препарат выпускают  в виде сухой биомассы. Лиофилизированной  в ампулах или флаконах. Массовая доля влаги сухого препарата должна быть не более 3,5%.

Все работы, связанные с  пересевом, разведением, определением физико-химических характеристик бифидумбактерина, требуют соблюдения стерильности и  проводятся в вытяжных шкафах или  на лабораторных столах над кюветами, на дно которых помещены коврики, смоченные 10%-ным раствором перекиси водорода.

Технология производства бифидумбактерина включает следующие  стадии: приготовление питательных  сред, выращивание посевного материала, культивирование, сублимационное высушивание, приготовление лекарственных форм, контроль готового препарата.

Приготовление питательных  сред. Для культивирования бифидобактерий используют среду Блоурокка или  среду на основе гидролизата казеина.

В состав среды Блоурокка  входят агар микробиологический, натрий хлористый, пептон сухой, лактоза, печёночный бульон, цистин. Срок хранения питательной  среды не более 7 сут при температуре 20±5ºС.

Срок хранения сред на основе гидролизата казеина не более 72 ч  при температуре 20±5ºС.

Стадия выращивания посевного  материала. Посевы бифидобактерий инкубируют при температуре 38±1ºС в течение 60±12 ч. Контрольные посевы инкубируют при температуре 22±2ºС в течение 8 сут. При этом получают бифидобактерии 1-ой генерации.

Следующий этап – получение  бифидобактерий 2-ой генерации. Засев  культуры проводят из расчёта 10% от объёма среды. Культура бифидобактерий и контрольные  посевы инкубируют при той же температуре  в матрасах, что и для посева 1-ой генерации. Общее время также  аналогично времени для посевов 1-ой генерации. Контроль посевной культуры проводится при высевании бифидобактерий 2-ой генерации в пробирки с глюкозой, средой Сабура и приготовлении мазка, окрашенного по Грамму.

При отсутствии роста в  контрольных пробирках и наличии  типичного роста бифидобактерий в виде рыхлого зернистого осадка, полученную культуру используют для  посева в биореактор.

Культивирование. Культивирование  бифидобактерий проводят в биореакторах марки БИОР. После проверки на герметичность  и обработки фильтров биореактор стерилизуют при 130ºС в течение 90 мин. Затем в него вводят гидролизатно-молочную или казеиноводрожжевую среду. Засев  питательной среды проводят бифидобактериями 2 – 3-ей генерации.

После культивирования проводят контроль биомассы. Биологическая концентрация бифидобактерий должна быть не менее 10⁸ клеток/мл, посторонняя микрофлора должна отсутствовать, рН = 7,1 ± 0,1. Затем готовят среду высушивания и вводят в биореактор. Биомассу со средой высушивания перемешивают 3±0,5 мин механической мешалкой, разливают в стерильные ёмкости аппарата «Магнолия» и передают на участок розлива в ампулы.

Сублимационное высушивание  биомассы. Розлив биомассы в ампулы производится при постоянном перемешивании. В начале, середине и конце розлива  отбирают пробы для определения  посторонней микрофлоры и жизнеспособности бифидобактерий, равномерности и  точности розлива. Заполненную ампулами кассету прикрывают несколькими  слоями стерильной марли, металлической  крышкой и передают для замораживания  в низкотемпературную установку  Масс-5, где выдерживают препарат при температуре минус 40±2ºС в  течение 48 ± 2 ч.

Высушивание проводят при  давлении 13,3 ± 0,13 Па и температуре  минус 30 ± 4ºС в течение 24 ± 2 ч, далее  температуру повышают до + 28 ± 2ºС в  течение 16 ± 2 ч и выдерживают 20 ± 2 ч.

После окончания процесса высушивания производится запайка  ампул. Герметизацию ампул осуществляют не позднее 72 ч после окончания  лиофилизации на автомате для запайки  ампул в атмосфере азота.

Получение готовой лекарственной  формы. Пятой стадией производства бифидумбактерина является маркировка и упаковка препарата. В помещении  контроль производят проверку герметичности  ампул и визуальный контроль.

Ампулы, прошедшие контроль и осмотр, отправляют на маркировочную  машину, затем укладывают по 10 штук в пачки из картона. В каждую пачку  вкладывается инструкция по применению препарата.

Контроль готового препарата  осуществляется по следующим показателям: физические свойства, внешний вид, отсутствие посторонней микрофлоры, количество живых бифидобактерий в одной  дозе препарата, активность кислотообразования, остаточная влажность, рН, герметичность.

Аппаратурное оформление процесса выглядит следующим образом (Рис.2):