Проявление окислительного стресса при действии неблагоприятных температур

О₂^. + О₂^. + 2Н⁺ = Н₂О₂ + О₂

Перекись водорода образуется не только в результате нейтрализации О₂ супероксиддисмутазой, но и в других реакциях, особенно интенсивно протекающих в пероксисомах. В зеленых тканях Н₂О₂ образуется в фотодыхательном цикле при участии гликолатоксидазы, а также при окислении аминокислот, пуринов и других соединений. Перекись является более стабильным продуктом, чем О₂^., и может диффундировать в клетке на значительные расстояния и даже пересекать мембраны через аквапорины. [6]

Другой и самый опасный  продукт неполного восстановления молекулы кислорода — гидроксилрадикал (ОН^·) — образуется в реакции Фентона при участии ионов железа:

О₂^. + Fe³⁺ → Fe²⁺ + О₂

Н₂О₂ + Fe²⁺ → Fe³⁺ + ОН^- + ОН^.

О₂^. + Н₂О₂ → ОН^- + О₂

Образование гидроксилрадикала  фиксируется при патологических состояниях. Он очень реакционноспособен и может окислять практически все. Его появление связано с осуществлением накоплением перекиси. Однако время жизни ОН^- мало (10^-9 с), и он не может диффундировать на значительные расстояния от мест своего образования. Таким образом, реальными АФК в клетке являются О₂^. и Н₂О₂, образующиеся в нормальных физиологических условиях в разных процессах и реакциях.

Супероксидрадикал и  перекись, будучи химически активны, способны реагировать с разными  соединениями, что может привести к деградации липидов и белков, вызывать повреждение ДНК и дезорганизацию цитоскелета. Так, АФК могут вступать в редакцию с полиненасыщенными жирнокислотными цепями в составе фосфолипидов формирующих бислой мембраны, и тем самым спровоцировать прцесс перекисного окисления липидов. В результате цепной реакции окисление, идущей с образованием свободнорадикальных продуктов, нарушаются гидрофобность липидного бислоя и его проницаемость. [2,7,8]

Синглетный кислород (О₂^.) регенерируется при изменении спина одного из электронов, находящегося на ¶ - орбиталях О₂. Это одна из наиболее реакционно-способных форм активированного кислорода. Установлено, что ¹О₂ окисляет различные органические молекулы, включая липиды, белки, аминокислоты, нуклеотиды, углеводы, тиолы и др., реагируя по двойной связи с образованием различных гидроперекисей. Возникновение ¹О₂ происходит в основном в фотоиндуцированных реакциях при участии хлорофиллов, других порферинов, флавинов. Мономерные молекулы хлорофилла являются более эффективными фотогенераторами ¹О_2, чем их агрегаты. Образование ¹О₂ возможно также в реакциях дисмутации О^-₂, НО₂, ОН^., Хабера-Вайсса и при работе ферментов (СОД, каталазы, пероксидазы):

2О₂ + 2(ОН^.) → Н₂О₂ + 2¹О₂

Н₂О₂ + О^-₂ → ¹О₂ + ОН^. + ОН⁺

2 Н₂О₂ → 2Н₂О + ¹О₂

Перекисный радикал (RO^·₂) возникает в результате взаимодействия О₂ с органическими радикалами. Реагируя с находящимися рядом липидами, он инициирует цепные реакции окисления. [9]

К АКФ относят озон (О₃). Он проникает в растения через устьица и, взаимодействуя с водой, образует  , Н₂О₂, ОН^. И другие радикалы О₃ и его производные вызывают окисление и перекисное окисление липидов.

В последнее время  возрастает интерес к производному кислорода – окиси азота (NO) и особенно к его радикалу (NO^.). Окись азота быстро реагирует с О₂, супероксидом и ионами металлов переменной валентности. Продукты взаимодействия NO^. с О^-₂ приводит к генерации крайне токсичного и мощного оксиданта – пероксинитрита (ОNOО^-), а также ОН^.. У растений NO может образовываться в результате химических превращений NO₂, при работе НАД(Ф)Н - зависимой нитратредуктазы. [8,10]

 

1.1.1 Антиоксидантная  защита растительной клетки

 

Свободнорадикальные процессы и перекисное окисление липидов (ПОЛ) в нормальных условиях необходимы для регулирования липидного  состава и проницаемости мембран, ряда биологических процессов. Стационарное состояние обеспечивается функционированием сложной системы ингибиторов свободного окисления. Эта система включает антиоксиданты, которые представляют собой соединения различной химической природы (витамин Е, коэнзим Q, глутатион, аскорбат), а также специализированные ферментные системы (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, глутатионтрансфераза, аскорбатпероксидаза и др.), способные тормозить или устранять свободнорадикальное окисление органических веществ.[11]

 

1.1.2 Низкомолекулярные  антиоксиданты

 

На процессы ПОЛ существенно  влияют низкомолекулярные антиоксиданты (АО). К ним относятся разнообразные  соединения – глутатион, аскорбат, токоферолы, каротиноиды, полиамины, некоторые  аминокислоты и др. В целом все эти вещества можно подразделить на две группы: липорастворимые антиоксиданты и водорастворимые антиоксиданты.

Липорастворимые АО (ά-токоферол  и каротиноиды) играют главную роль в защите основных структурных компонентов  биомембран, таких как фосфолипиды и погруженные в липидный слой белки.

Водорастворимые антиоксиданты (тиоловые соединения и аскорбиновая кислота), в свою очередь, проявляют  свое защитное действие в водной среде  – цитоплазме клетки, инактивируя  попадающие туда свободные радикалы. [12]

ά - токоферол (витамин  Е) – липорастворимый антиоксидант, расположенный в клеточной мембране. Содержится в семенах злаков и  в растительных маслах, получаемых холодной выжимкой. ά - токоферол содержит фенольное кольцо с системой сопряженных  двойных связей, поэтому он легко отдает электрон свободным радикалам, восстанавливая их до стабильных продуктов. Феноксил-радикал, который при этом образуется, сам по себе достаточно стабилен и в продолжении цепи не участвует.

Биофлавоноиды - большая  группа полифенолов, которые содержатся в водных экстрактах различных растений. Некоторые биофлавоноиды действуют как ловушка гидроксил-радикала (катехин, эпикатехин, рутин). Другие (кверцетин) не снижают содержание гидроксила, зато ингибируют продукцию супероксиданион-радикала (СОД-подобная активность). Третьи (морин) не влияют ни на гидроксил, ни на супероксиданион-радикал, но, тем не менее, проявляют высокую антиоксидантную активность. [10,13]

Каротиноиды - красные  и оранжевые растительные пигменты. Относятся к липорастворимым антиоксидантам. Наиболее известен бета-каротин, который является предшественником витамина А. Все каротиноиды в той или иной степени являются ловушками синглетного кислорода. Каротиноиды содержатся в красных и оранжевых фруктах и овощах, а так в их масляных экстрактах и некоторых маслах. Наиболее богато каротиноидами масло облепихи, шиповника, пальмовое масло.

Убихинон (коэнзим Q) - фенол, по химической структуре близок к  токоферолам. Он содержится в митохондриях, где участвует в работе дыхательной цепи. Убихинон обладает высокой антиоксидантной активностью, причем его эффективность в пять раз выше, чем у витамина Е. Это весьма существенно для митохондрий, где идут активные окислительные процессы и постоянно образуются свободные формы кислорода. [14]

Аскорбиновая кислота (витамин С) является мощным восстановителем, который предохраняет от окисления  целый ряд биологически активных веществ. Витамин С входит в состав алифатического ряда витаминов. Благодаря  наличию двух асимметричных атомов углерода в 4 и 5 положениях, аскорбиновая кислота (АК) образует 4 оптических изомера и 2 рацемата. Наличие в АК двух сопряжённых двойных связей (углерод-углеродной и углерод-кислородной) обуславливает ее способность к обратимому окислению, продуктом которого является дегидроаскорбиновая кислота (ДАК). Аскорбиновая кислота синтезируется в растениях из D-глюкозы через лактон D-глюкуроновой кислоты и L-гулоно-γ-лактон или их производное. [9,15]

Глутатион содержит SH-группу и относится к тиоловым соединениям. При окислении две молекулы глутатиона образуют дисульфидную связь:

2Г – SH = Г – S – S – Г + 2Н^.

Служит восстановителем  в глутатионпероксидазной реакции. Необходим прежде всего для восстановления витамина С в активную форму. В  условиях in vitro и в присутствии  окислителей витамин С разрушается за считанные минуты. Однако, в клетке, где обязательно есть тиоловые соединения, даже ничтожные количества аскорбата будут эффективной защитой от окисления. Антиоксидантный эффект аскорбиновой кислоты и глутатиона реализуется главным образом посредством их участия в работе ферментативных антиоксидантов, особенно ферментов аскорбат-глутатионового цикла. Кроме того, они способны непосредственно ингибировать АФК, легко перехватывая О₂^-. Глутатион и аскорбат выполняют многочисленные функции в регуляции метоболизма растений, в частности, участвуют в поддержании окислительно-восстановительного потенциала. [16]

 

1.1.3 Антиоксидантные  ферменты

 

У растений  АФК удаляются  рядом ферментов: СОД, аскорбат пероксидазой, моно- и дегидроаскорбат-редуктазой, глутутион-пероксидазой, глутатион-редуктазой, каталазой и гваякол-пероксидазой. Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленной против определенных АФК, специфичностью клеточной и органоидной локализации, использованием в качестве катализаторов металлов (Cu, Zn, Mn, Fe, Se), (Рисунок 1.1).

Супероксиддисмутаза и  каталаза - важнейшие компоненты антиокислительной  системы всех клеток организма растений. Супероксиддисмутаза (СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона:

О₂^- + О₂^- + 2Н⁺ → Н₂О₂ + О₂

Образующиеся в супероксиддисмутазной  реакции гидропероксид сам является сильнейшим окислителем. [17] Каталаза локализованной в пероксисомах, не позволяет накапливаться перекиси водорода:

2Н₂О₂ --> 2Н₂О + О₂

Наиболее высокая активность каталазы (АК), разлагающей перекись водорода, обнаружена в эритроцитах  рыб, обитающих в ручьях с большим  содержанием кислорода. Одним из главных параметров определяющих скорость ПОЛ, является активность каталазы. Каталаза (КФ.1.11.6) – гемсодержащий фермент класса оксидоредуктаз с молекулярной массой 248 000 Да. В состав молекул каталазы входят 4 геминовых группы, оптимум pH = 6,8-7,0, температурный оптимум активности, в отличие от других ферментов, лежит в области 0-10С°, что обусловлено разрушающим действием перекиси водорода на каталазу при более высокой температуре.

Суммарное течение каталазной реакции отвечает уравнению:

2 H₂O₂ = 2 H₂O + O₂,

Однако реакция протекает  через образование промежуточных  комплексов, представляющих соединение каталазы с перекисью водорода. Спектральное исследование показало существование по крайней мере, двух комплексов –  «зеленого продукта П» и «красного продукта П». «Зеленый продукт П» является первым промежуточным продуктом каталазной реакции. Затем этот комплекс реагирует со второй молекулой перекиси водорода, которая в этом случае служит донором водорода [18].

Каталаза (КФ. 1.11.6) относится  к ферментам, которые наиболее длительно  сохраняют активность, почти не требуют  энергии активации, скорость реакции этого фермента лимитирует лишь скорость диффузии субстрата к активному центру. Главной функцией фермента является предотвращение накопления перекиси водорода, образующейся при дисмутации супероксидного аниона и при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов. Перекись водорода также образуется в клетках при действии некоторых окислительных ферментов. Помимо перекиси водорода каталаза разлагает также, но более медленно, метилпероксид и этилпероксид, Кроме того, в присутствии перекиси водорода каталаза окисляет низкомолекулярные спирты, а также нитриты. Таким обр6азом, по скорости ферментативной реакции каталаза является более мощным ферментом в природе [19].

Пероксидаза – гем–содержащий белок, участвующей в утилизации пероксида водорода, катализирующий Н₂О₂-зависимое окисление широкого ряда субстратов (SН₂) по уравнению:

SН₂ + Н₂О₂  → S + 2 Н₂О

В растениях обычно содержится много изоферментов пероксидаз с  неспецифической активностью. В  качестве субстратов могут использоваться различные соединения, но чаще фенольные или индольные. Пероксидазы присутствуют в различных компертментах клетки (хлоропласты, митохондрии,пероксисомы, цитозоль), участвуют в детоксикации Н₂О_2.. [20]

Рисунок 1.1 Взоимодействие антиоксидонтных ферментов с  перекисью водорода (В.Н. Попов, Н.В. Кипайкина, Н.В. Астахова, Т.И. Трунова, 2006)

 

Глутатионпероксидаза - использует глутатион для восстановления перекиси водорода и липидных гидроперекисей до нейтральных и малотоксичных  соединений.

H₂O₂ + 2GSH → GSSG + 2H₂O

-LOOH + 2GSH → GSSG + -LOH + H₂O

Окисленный глутатион (GSSG) снова восстанавливается глутатионредуктазой:

GSSG + НАДФН → 2GSH - НАДФ+

Для эффективной работы глутатионпероксидазы необходим, селен, который входит в состав активного  центра фермента. [7,14]