Проявление окислительного стресса при действии неблагоприятных температур

Аскорбат-пероксидаза  локализована в хлоропластах и является там главным ферментом, утилизирующим  перекись водорода, так как хлоропласты, по-видимому, не содержат каталазы. Фермент  высоко специфичен к аскорбату и  быстро теряет активность в его присутствии. В результате аскорбат-пероксидазной реакции образуется монодегидроаскорбат-радикал (МДГАск^.), который восстанавливается до аскорбата (Аск) стромальной монодегодроаскорбатредуктазой:

Н₂О₂ + Аск → 2 МДГАск^. + 2 Н₂О

2 МДГАск + НАД(Ф)Н → 2 Аск + НАД(Ф)⁺

Глутатионредуктаза (ГТ) (NAD(P)H' окисленный глутатион оксидоредуктаза) - широко распространенный флавиновый фермент, поддерживающий высокую внутриклеточную концентрацию восстановленной формы глутатиона (GSH). Т.Гопкинс в 1931 г. открыл сопряженную с регенерацией окисленного NAD систему восстановления окисленного глутатиона (GSSG), а глутатионредуктаза была обнаружена в 1951 г. .Конном.

 В растениях глутатионредуктаза является одной из наиболее крупных белковых молекул. Глутатионредуктаза катализирует обратимое NAD(P)H-зависимое восстановление GSSG с образованием 2 молекул GSH:

GSSG + NAD(P)H + H⁺ → 2 GSH +NAD(P)

Вместо НАДФН в реакции  может также участвовать восстановленный  никотинамидадениндинуклеотид (НАДН). ГР обладает высокой специфичностью к глутатиону. С очень низкой скоростью может катализировать восстановление других дисульфидов.

ГР состоит из 2 одинаковых субъединиц (мол. масса каждой 50-55 тыс. Да), полость между которыми в  ходе реакции занимает окисленный глутатион. Субъединицы содержат по 4 структурных домена. На одном конце каждой из них расположен остаток коферментной формы рибофлавина — флавинадениндинуклеотида, на другом - НАД (Ф)

Глутатионтрансфераза (ГТ)- это семейство ферментов, катализирующих коньюгацию различных ксенобиотиков. Каталитическая активность ГТ обеспечивает клетку механизмом защиты от вредного воздействия этих веществ. Многофункциональное семейство ГТ играет существенную роль в метаболизме липидов, продуктов свободнорадикальных реакций и т.д. [5,8,13]

ГТ защищает от гидрофобных  продуктов ПОЛ посредством их восстановления, присоединения молекулы GSH или нуклеофильного замещения гидрофобных групп:

ROOH + 2 GSH → ROH + GSSG + H₂O

R + GSH → HRSG

RX + GSH →RSG + HX

 

1.2 Проявление  окислительного стресса у растений

 

Интенсификация окислительных  процессов, происходящая при действии на растительные организмы разнообразных  стрессоров, вызывает многочисленные нарушения, приводящие к повреждению и гибели. Так, с окислительным стрессом связывают повреждения водорослей и высших растений под действием ряда абиотических, биотических и антропогенных стрессоров. [21]

Воздействие на растения различных стрессовых факторов приводит к ответной реакции многих физиологических показателей. Известно, что глубинный механизм любого повреждения - это разрушительное действие свободных радикалов активного кислорода или пероксида водорода.

Избыток свободных радикалов и недостаток антиоксидантов в растениях сдвигает баланс обменных процессов в растении в пользу свободных радикалов и происходит переокисление липидов мембран, белков, ДНК и других молекул клетки и, как следствие, повреждение и гибель клеток, тканей и целых растений. При наблюдается некротическая реакция на листьях различных культур, их осыпание, появление нетипичной для сорта антоциановой окраски листьев и плодов яблони, груши, крыжовника и др. Ослабленные и поврежденные ткани листовой пластинки были более уязвимы для патогена. [20,22] Это, в свою очередь, снизило их защитный потенциал от потока солнечной энергии и привело к быстрому развитию некрозов. (Рисунок 1.2)

 

 

 

 

Рисунок 1.2 Повреждение  листьев абиотическими стрессорами (Чирков Т.В., 2002)

 

При действии пониженных температур возможно развитие окислительного стресса, связанное со снижением  антиокислительной активности тканей. При пониженных температурах может  происходить  фотоокислительное  повреждение фотосистем в мембранах  хлоропластов, проявляющееся усилением ПОЛ, деградацией хлорофиллов, каротина, белков, ксантофиллов.

В последние годы развивается  теория возникновения окислительного стресса при воздействии тяжелых  металлов. Они могут продуцировать  образование активных форм кислорода. Через реакцию Хабера-Вайсса ионы ТМ играют важную роль в окислительных модификациях свободных аминокислот и белков. [23]

 

1.2.1 Механизмы  повреждающего действия абиотических  стрессоров на клеточном уровне

 

По мнению многих отечественных  и зарубежных исследователей, самые различные по природе повреждающие факторы воздействия на растения, затрагивающие сопряженность биохимических процессов или активность защитных систем, стимулируют образование атомарного кислорода, анион-радикал супероксида (О₂^.) , гидроксильного радикала (ОН^.), перекиси водорода (Н₂О₂), органические перекиси и их радикалов. Во взаимодействии различных форм кислорода с клеточными органеллами могут доминировать различные механизмы, но результат будет один - окислительная деструкция липидов и пигментов фотосинтетических мембран. Основным инициатором свободнорадикального окисления мембранных липидов клетки является супероксид, т.к. он легко генерируется во многих спонтанных и энзиматических реакциях окисления, и продуктами его вторичных превращений могут быть О₂^., ОН^., Н₂О₂. Образованием супероксида в клетке объясняется действие на растение экстремальных температур, УФ-радиации, различных поллютантов, поскольку при этом наблюдается корреляция между активностью эндогенной супероксиддисмутазы (СОД), катализирующей превращение супероксида в Н₂О₂ и О₂ и устойчивостью растений к этим воздействиям. [1,4,5]

Свободные радикалы продуцируются  в больших количествах в условиях холодового стресса, засухи, недостатка кислорода, интенсивной солнечной  радиации, при воздействии озона, окислов серы и азота, тяжелых металлов и многих других повреждающих факторов. При воздействии на клетку стрессовых факторов происходит нарушение ее структуры и функции, сначала под непосредственным воздействием стресса, а далее оно резко усиливается за счет включения свободно-радикального механизма повреждения.

Так, при сочетании  двух стрессовых факторов – переувлажнения и повышенной солнечная активности - ингибируется фотосинтез, нарушается биосинтез защитных соединений (антиоксидантов) - каротина, фенольных соединений, флавонолов, витамина Е, С и др., и интенсивно усиливается образование свободных радикалов: супероксида, перекиси водорода, гидроксилрадикала и синглетного кислорода. Ингибированная в результате низкой температуры воздуха и высокой влажности и плотности почвы, деятельность фотосинтетического аппарата не обеспечивает формирование эффективной защитной системы (морфологической и физиологической), что является фактором, препятствующим достаточной утилизации активного потока электронов, вызванного всплеском солнечного света. В этом случае происходит значительное усиление внутриклеточных окислительных процессов, вызванное потоком фотонов, и ионы активного кислорода начинают разрушать липиды мембран клеток, белковые структуры, ДНК и т.д. Внешне это проявляется в виде обширных некротических повреждений хлорофилл-содержащих тканей. [5]

Помимо этого, переувлажнение и запоздалое прогревание почвы  угнетает деятельность корневой системы, поглощение жизненно-важных элементов  питания, что еще больше ослабляет защитную систему растений. При кислородном голодании подавляется дыхание корней, синтез АТФ и зависящие от него процессы, нарушается снабжение надземной части растения водой, элементами минерального питания, гормонами (цитокининами) и другими продуктами жизнедеятельности корня. Все это грозит гибелью растению. Избыток свободных радикалов и недостаток антиоксидантов в растениях сдвигает баланс обменных процессов в растении в пользу свободных радикалов и происходит переокисление липидов мембран, белков, ДНК и других молекул клетки и, как следствие, повреждение и гибель клеток, тканей и целых растений.

В последний период из всех факторов окружающей среды особое значение придается ультрафиолетовому (УФ)-излучению, входящему в состав электромагнитного излучения Солнца и составляющему около 7% солнечной радиации, достигающей поверхности Земли. В связи с тем, что фотоны УФ имеют энергию, достаточную для ионизации атомов, они поглощаются всеми биологически важными структурами, определяя этим высокую биологическую активность УФ-излучения, особенно УФ-В. Эффекты, вызываемые УФ-излучением, обнаруживаются на всех уровнях организации растений, от молекулярного до организменного. В основе их лежит фотохимическая деструкция важнейших макромолекул клетки. При избытке влаги и азота мезоструктура листа характеризуется меньшей толщиной эпидермиса и кутикулы, вследствие чего еще в большей мере повышается чувствительность растений к УФ-В. Этому же способствует и сильный рост побегов. При повышенной активности роста клетки могут быть недостаточно дифференцированы, имеют крупную вакуоль, которая способна, неумеренно растягиваясь при переувлажнении, нарушать внутренние структуры клетки. Мембраны подобных клеток недостаточно выполнены и легко подвергаются разрывам, в результате клетки гибнут – т.е. появляются видимые некрозы ткани. [9,14,17]

Пониженные температуры  вызывают многочисленные нарушения  ультраструктуры клеток теплолюбивых растений. При этом различные клеточные  элементы проявляют неодинаковую реакцию  на охлаждение. Клеточная стенка остается интактной, в ней обнаруживаются отложения новых слоев. В цитоплазме уменьшается электронная плотность. Холодовое повреждение ядра проявляется в виде обособления и конденсации хроматина, просветления кариоплазмы. Уменьшается число рибосом, увеличивается вакуолизация и уменьшается объем вакуолярных белковых телец. При холодовой аклимации происходит процесс перераспределения мембран, ответственных за повышение холодоустойчивости. Увеличение числа мембран в клетке при небольшом охлаждении относят к адаптивным изменениям. При более сильном охлаждении происходит разрушение мембранных структур, приводящее к нарушению деятельности органелл и расстройству физиологических функций клеток в целом. [25]

 

 

1.3 Действие  неблагоприятных температур на функциональные процессы растений

 

При действие температуры  сдвигается подвижное равновесие между  перекисным окислением липидов (ПОЛ) и  антиоксидантной системой защиты.

Образуются продукты ПОЛ могут выступать как первичный  сигнал неблагоприятного воздействия температуры и включать соответствующие защитные механизмы (активация супероксиддисмутазы, мобилизация низкомолекулярного антиоксидантного резерва), что, в конечном счете, приводит к повышению устойчивости ратсений.

Хорошо известно, что  температурный стресс подавляет ростовые процессы, как при низких  так и при повышенных температурах. Экстремальные условия в разной степени подавляют ростовые процессы и снижают урожай, воздействуя на растения в разные фазы онтогенеза [13]. Известно, что наиболее чувствительными растения к экологическим стрессам в молодом возрасте. Как правило, влияние неблагоприятных факторов наиболее ярко проявляется в депрессии ростовых процессов вегетативных органов, т.е. тех процессов, которые являются интегральным выражением всех повреждаемых синтетических реакций в метаболизме растений. Именно в депрессии ростовых процессов, проявляется значительная корреляция между силой и длительностью стресса, с одной стороны, и степенью депрессии роста, с другой (Удовенко, 1997). Причем, этот показатель (интенсивность роста) очень четко и быстро реагирует на различные изменения условий среды.

В одних и тех же экстремальных условиях, как виды, так и сорта одного вида культурных растении снижают сою продуктивность в неодинаковой степени. Это указывает на различную степень устойчивости сортов и видов. Обычно растения характеризуются по высокой, средней и низкой степени устойчивости к температурному стрессу. В настоящее время нет единой теории объясняющей механизм термоустойчивости растений с ключевыми процессами обмена веществ [26].

В последние годы получило развитие представлений о развитии термоустойчивости растений как  генетически закрепленном признаке растений как генетически закрепленном признаке. Предполагают, что термоустойчивость генетически детерминирована. На это указывает влияние ингибиторов процессов транскрипции и трансляции на устойчивость растений (Трунова ,1985). Пологают, что в основе реакций растений на закаливающие низкие и высокие температуры лежит единый механизм – индуцированный синтез белков [27].

 

1.3.1 Влияние пониженной температуры на растения

 

В исследованиях Л.А. Паничкина, М.С. Красавиной на листьях огурца было установлено, что низкая температура приводит к быстрому уменьшению водного потенциала листа, и как следствие этого закрывание устьиц.

Механизм закрывания устьиц при охлаждении, связан с  работой ионных каналов и концентрацией  кальция в цитоплазме устьичных  клеток. Существуют различные предположения  на счет этого, одни предполагают прямой эффект действия холода на устьичные клетки, другие полагают, что увеличение концентрации СО₂ в межклетниках при уменьшении фотосинтеза ведет к закрытию устьиц при низких температурах [27].

Ю. Е. Колупаев, Ю. В. Карпец предполагается, что активация НАДФН-оксидазы может быть причастна и к повреждениям растений, вызываемым экстре-мальными температурами. Так, холодовому по-вреждению растений огурца предшествовало повышение активности этого фермента и накопление пероксида водорода (Shen et al., 2000) [14]. Предобработка растений полиамином спермидином предотвращала индуцированное охлаждением увеличение содержания H2O2 в листьях, активности НАДФН-оксидазы и НАДФН-зависимого образования супероксида в микросомах, а также ослабляла холодовое повреждение [27].

А. Ф. Титов, С. А. Фролова, В. В. Таланова в листьях проростков огурца (Cucumis sativus L.), подвергнутых действию низких повреждающих и закаливающих температур, изучали активность сериновых протеиназ (амидаз), цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина. Показано, что под влиянием повреждающей температуры (5 ⁰С) происходит быстрое и значительное увеличение активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина. При действии закаливающей температуры (10 ⁰С) также отмечено некоторое усиление активности протеиназ и ингибиторов, которое предшествует во времени повышению холодоустойчивости проростков. Однако при достижении максимальной устойчивости активность амидаз и ингибиторов трипсина снижается, в то время как активность цистеиновых протеиназ сохраняется на достигнутом уровне в течение всего процесса закаливания растений. Полученные результаты свидетельствуют об участии цистеиновых протеиназ, амидаз и ингибиторов трипсина взащитно-приспособительных реакциях растений огурца на действие как повреждающих, так и закаливающих температур [28].