Жидкостная хроматография

Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), данные системы обладают рядом недостатков, среди которых основным, пожалуй, является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов подвижной фазы еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем - систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления.

Принципиальным отличием систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления является смешение компонентов в линии высокого давления, естественно, что при данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания подвижной фазы. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.

На рисунке 3 изображена схема изократического хроматографа градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления.

Рисунок 3 - Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления

1 - резервуары; 2 - прецизионный насос высокого давления; 3 – ручной инжектор; 4 – предколонка, разделительная колонка; 5 – детектор; 6 - аналоговый регистратор; 7  -  сливная емкость; 8 – in-line фильтр;  9  -  входной фильтр; 10 - динамический смеситель потока; 11- прецизионный насос

Подвижная фаза из емкостей  через входные фильтры подается прецизионными насосами высокого давления через статический или динамический смеситель потока в систему ввода образца - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой управляемых насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос “master pump” или контроллер), либо управляющая программа ПК. В этом случае все насосы являются управляемыми. Системы такого типа формируют бинарный или трехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр, образец с током подвижной фазы поступает в элемент разделения - через предколонку в разделительную колонку. Затем элюат поступает в детектор и удаляется в сливную емкость . При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д. На схемах, также отдельно не показаны манометрические модули. Как правило, эти устройства встраиваются в насосные блоки. Эти блоки могут объединять в себе несколько насосов, насос с программатором градиента, а также общий системный контроллер. Структура системы зависит от ее комплектации и каждого конкретного производителя.

Такое радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам подвижной фазы, отсутствующих в классической колоночной и планарной хроматографии. Жидкая фаза должна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.

Глава 2 Описание спектрофотометрических методов анализа

2.1 Особенности отдельных методов анализа

Жидкостная хроматография разделяется на жидкостно-адсорбционную (разделение соединений происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента), жидкостно-жидкостную, или распределительную (разделение осуществляется за счет различной растворимости в подвижной фазе - элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твердого адсорбента), ионообменную хроматографию, где разделение достигается за счет обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента - ионита.

В основу одной из разновидностей ЖХ - ион-парной (ИПХ) положены принципы классической экстракции ионных веществ из водной в органическую фазу в виде ионных пар. Для этого в подвижную фазу добавляется противоион, способный вступать в селективное комплексообразование с анализируемыми компонентами с образованием ионной пары. Основные преимущества такого варианта заключаются в том, что одновременно могут быть проанализированы вещества кислотного, основного и нейтрального характера.

При выборе условий разделения необходимо учитывать молекулярную массу компонентов образца, их полярность и природу сопутствующих соединений. Если молекулярная масса превышает 2000 у.е., то обычно обращаются к методу эксклюзионной, или гель-хроматографии. Во всех остальных случаях решение задачи разделения многокомпонентной смеси возможно в принципе осуществить методами адсорбционной или распределительной ЖХ в нормально- или обращенно-фазовом варианте (ОФ). Нормально-фазовый режим предпочтителен, если анализируемые вещества содержат различные функциональные группы. При этом имеют значение количество функциональных групп, способность анализируемых соединений к образованию водородных связей, строение (например, цис-трансизомерия). Если вещества обладают слабым сродством к подвижной фазе, то используют активные слои сорбента и слабо полярные растворители. К ОФ-хроматографии прибегают при разделении гомологов, сильно полярных веществ, анализ которых на полярных сорбентах неэффективен, а также соединений, сродство которых к полярной неподвижной фазе незначительно.

По оценкам авторитетных специалистов, 70% хроматографических анализов проводят методом ОФ ВЭЖХ; разработаны и внедрены сорбенты на основе силикагеля с химически привитыми алкильными радикалами. Чаще всего применяют сорбенты с С8- и С18-группами, стабильные в водных растворах в интервале рН 2-8. Этим объясняется их эффективное использование при анализе биологических объектов. Методом ОФ ВЭЖХ осуществляется определение важнейших нейромедиаторов (от лат. mediator - посредник; медиаторы передают информацию в живом организме, меняя ионную проницаемость наружных клеточных мембран) в плазме крови, спинномозговой жидкости, что имеет большое значение для диагностики различных заболеваний мозга (паркинсонизм, эпилепсия, шизофрения, болезнь Альцгеймера). Времена выхода компонентов, отсчитываемые от момента ввода пробы до регистрации вершины хроматографического пика, или, иначе, объемы подвижной фазы, затраченные на перенос через колонку каждого компонента, дают качественную характеристику анализируемых веществ (рис. 3). Сопоставление площадей (или высот) хроматографических пиков позволяет выполнять количественные определения.

Особое место в использовании методов жидкостной хроматографии в медицине занимают эксклюзионная, или гель-хроматография и аффинная, или биоспецифическая.

В основе этого варианта ЖХ лежит принцип разделения смеси веществ по их молекулярным массам. В эксклюзионной (от англ. exclusion - исключение; устаревшее название - ситовая) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их различной способности проникать в поры сорбента. Подвижная фаза - жидкость, а неподвижная - та же жидкость, заполнившая поры сорбента (геля). Если молекулам анализируемого вещества недоступны эти поры, то соответствующее соединение выйдет из колонки раньше, чем то, у которого размеры молекул меньше. Молекулы или ионы, размеры которых находятся между максимальным и минимальным диаметром пор геля, разделяются на отдельные зоны. С помощью этого вида хроматографии в Институте вирусологии в Москве в 1990 году был выделен вирус СПИДа.

Особенно интенсивное развитие эксклюзионная хроматография получила в последние два десятилетия, чему способствовало внедрение в химическую и биохимическую практику сефадексов - декстрановых гелей, поперечно сшитых эпихлоргидрином. На различных типах сефадексов можно фракционировать химические вещества с различными молекулярными массами, поэтому их широко используют для выделения и очистки биополимеров, пептидов, олиго- и полисахаридов, нуклеиновых кислот и даже клеток (лимфоцитов, эритроцитов), в промышленном производстве различных белковых препаратов, в частности ферментов и гормонов. Были не только выделены и исследованы ранее неизученные белки, но и получена информация, заставившая пересмотреть некоторые традиционные представления. Так, при гель-фильтрации образцов плазмы крови животных и человека оказалось, что ростовые вещества выходят из колонки в основном не тогда, когда их ожидают согласно молекулярной массе (6-8 тыс. дальтон), а значительно раньше, то есть в одной фракции с высокомолекулярными белками. Выяснилось, что крупные пептиды, подобно низкомолекулярным веществам, могут циркулировать в крови в комплексе с белком-носителем. Это явление имеет важное физиологическое значение, и нарушение по каким-либо причинам биосинтеза белка-носителя приводит к серьезным патологиям. Сообщалось еще об одном интересном явлении, связанном с белковыми гормонами и обнаруженном в режиме эксклюзионной хроматографии. Установлено, что мономер гормона соматотропина (гормон роста), белка с молекулярной массой 21 тыс. дальтон, через несколько минут после его введения человеку или животному перераспределяется в крови по белковым фракциям с молекулярной массой вплоть до 100 тыс. дальтон. Причиной могут быть связывание его с каким-либо транспортным белком или собственная агрегация. Для другого гормона - кортикотропина, регулирующего функции надпочечников, перераспределение по фракциям сопровождается изменением биологической активности. Все это удалось выяснить благодаря гель-хроматографии.

Особое место в жидкостной хроматографии занимает так называемая аффинная, или биоспецифическая, хроматография (от англ. affinity - сродство). Аффинная хроматография (АХ) основана на исключительной способности биологически активных веществ связывать специфически и обратимо другие вещества. Научные основы метода заложены в 1951 году в США, хотя первые экспериментальные указания на большие потенциальные возможности АХ были получены еще в 1910 году. Штаркенштейном, использовавшим крахмал для выделения амилазы. В основе АХ лежит уникальное свойство биологически активных соединений узнавать строго определенные вещества, в процессе которого реализуется так называемый принцип молекулярного распознавания. Фермент узнает свой субстрат, антиген - антитело, гормон - рецептор. Как правило, каждый фермент катализирует определенный тип реакции. Возникновение соответствующего комплекса фермент - субстрат обусловлено строгим соответствием структур обоих участников комплексообразования.

Процесс разделения веществ с использованием АХ включает несколько самостоятельных этапов. Хроматографическую колонку заполняют носителем, ковалентно связанным с каким-либо биологически активным веществом (называемым аффинантом, или лигандом). В качестве носителей в АХ получили широкое распространение гранулированные гели агарозы и полиакриламида (биогель Р), полистирольные смолы с химически активными группами, целлюлоза и ее производные и т.д. Затем через колонку пропускают анализируемую смесь веществ, к одному из которых иммобилизованный лиганд обладает биологическим сродством. Выбирая из смеси требуемое соединение, аффинант образует с ним комплекс. Остальные компоненты пройдут через колонку, не задерживаясь [4]. Специфически адсорбированный фермент может быть освобожден из комплекса изменением природы элюента, рН или ионной силы. На рис. 4 представлены основные этапы аффиной хроматографии. Лигандами могут служить самые различные соединения: белки, пептиды, аминокислоты, витамины, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и многие другие вещества.

Иммобилизации лиганда на поверхности носителя обычно предшествует стадия его активации, то есть формирование реакционноспособных групп, взаимодействующих с лигандами. Непосредственное ковалентное связывание осуществляется редко, особенно если молекулы лиганда небольшие по размеру, что вызвано стерическими препятствиями из-за близкого расположения химически активных групп носителя. Для того чтобы погасить этот неблагоприятный эффект, связывание молекулы лиганда с поверхностью осуществляют через удлиняющий мостик, представляющий собой алифатическую цепочку из 2-10 атомов углерода. Активные группы носителя, оставшиеся несвязанными, блокируют соответствующими химическими агентами. Наиболее распространенный способ активации носителей, содержащих поверхностные гидроксильные группы, - обработка бромцианом в щелочной среде (рН ~ 11).

Образующиеся в результате имидокарбонатные группы легко присоединяют белки, пептиды и аминокислоты в качестве лигандов по их концевой свободной a-аминогруппе.

Оптически активные соединения играют исключительно важную роль во многих биологических процессах, их исследование имеет принципиальное значение для контроля оптической чистоты производимых пищевых продуктов, разделения рацематов. Эти соединения интересуют химиков с того момента, как выяснилась уникальная способность природы создавать подобные объекты.

2.2 Использование жидкостной хроматографии в анализе пищевой продукции

Жидкостная хроматография важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии

Источники  и  причины  загрязнений  пищевых продуктов могут быть самыми различными. В пищу попадают  загрязнения  из  окружающей  среды (преимущественно  из  воды,  почвы),  за  счет  природных  загрязнителей (микотоксинов),  при  нарушении  режима  хранения  пищевых  продуктов,  за счет  всевозможных  добавок (консерванты,  антиокислители,  красители,  искусственные  подслащи-вающие средства, ароматизаторы, горчащие веще-ства, эмульгаторы и др). Для ускорения роста и увеличения привеса ско-та  в  корма  добавляют  антибиотики,  сульфаниламиды, гормоны и др. На эти так называемые ветеринарные  лекарственные  соединения  устанавливают  определенные  нормы,  которые  часто  нарушаются.

Загрязнения  или  нежелательные  вредные  соединения попадают в пищевые продукты также из упаковочных  материалов,  после  термообработки или радиационного воздействия на пищевые продукты.  Токсичные  вещества  попадают  в  пищевые продукты и напитки при нарушении технологии их получения или обработки (например, нитрозоамины в пиве).  Большое распространение получила фальсификация пищевых продуктов и напитков, в частности растительных  и  сливочных  масел,  вин,  коньяков, минеральной  воды  и  других напитков.

  На основе ионной хроматографии разработана  методика  определения  бромата  в  питьевой озонированной  воде (бромат — потенциальный анцероген  при 0,05 мкг/л);  методика  официально  утверждена ИСО 15061:2001 . Для оценки экологического состояния морских вод предложено ионохроматическое определение соотношения иодида к иодату .

Приведенные  примеры  показывают  уникальные возможности жидкостного хроматографа в  контроле  загрязнений  окружающей  среды,  пищевых  продуктов  и  в клинических анализах.

Жидкостная хроматография может быть осуществлена в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).