Жидкостная хроматография

Глава 3 Анализ с использованием жидкостного хроматогрофа  

 

3.1 Методика измерения и расчетные формулы

 

С помощью хроматографического метода анализа можно определить количественное содержание жирорастворимых витаминов A (ретинола и его сложноэфирных форм), Е (α-токоферола и его сложноэфирных форм) и D3 (холекальциферола) в продуктах детского питания.

Для получения результата измерений проводят анализ двух параллельных проб, для каждой из которых выполняют по два измерения (получают по две хроматограммы). Массовая концентрация анализируемой i-го компонента (витамина А (ретинола), витамина Е (α-токоферола) и витамина D3 (холекальциферола)) в параллельных пробах, введенных в хроматограф (Ci1) и (Ci2), автоматически рассчитывается системой сбора и обработки хроматографической информации. Диапазоны измерений массовой доли витаминов представлены в таблице 1.

Талица 1- Диапазоны измерений массовой доли витаминов

Наименование  объекта	Диапазон  измерений  массовой  доли,  мг/кг	Показатель  точности  (границы  относительной  погрешности),   ±δ, %,  при Р=0,95	Показатель  повторяемости  (относительное  среднеквадрати-  ческое отклонение  повторяемости),  σr, %	Показатель  воспроизводимости  (относительное  среднеквадрати-  ческое отклонение  воспроизводимости),  σR , %	Предел  повторяемости,   r, %,  P=0,95, n=2
Витамин А	от 0,2 до 9,0 вкл.	20	6	9	17
	св. 9,0 до 50,0 вкл.	17	5	8	14
	св. 50,0 до 5000 вкл.	14	3,5	6	10

 

 

Продолжение таблицы 1

Наименование  объекта	Диапазон  измерений  массовой  доли,  мг/кг	Показатель  точности  (границы  относительной  погрешности),   ±δ, %,  при Р=0,95	Показатель  повторяемости  (относительное  среднеквадрати-  ческое отклонение  повторяемости),  σr, %	Показатель  воспроизводимости  (относительное  среднеквадрати-  ческое отклонение  воспроизводимости),  σR , %	Предел  повторяемости,   r, %,  P=0,95, n=2
Витамин Е	от 25,0 до 240,0 вкл.	32	10	15	28
	св. 240,0 до1500 вкл.	20	5	8	14
Витамин D3	от 0,5 до 50,0 вкл.	28	9	14	25
	св. 50,0 до 100 вкл.	14	4,5	7	12

 

Если массовая концентрация пробы, введенной в хроматограф, оказывается больше верхней границы диапазона градуировки (для витамина А – 0,0200 мг/дм3, для витамина Е – 0,1500 г/дм3, для витамина D3 – 0,0150 г/дм3), пробу перед вводом в хроматограф разбавляют спиртом изопропиловым. Коэффициент разбавления учитывают при расчете.

Рассчитывают среднее арифметическое значение массовой концентрации i-го компонента  в пробах, введенных в хроматограф (Ci1 и Ci2), по результатам двух измерений для каждой из параллельных проб по формуле:

Сiср  = ( Сi1 + Сi2 ) / 2             (1)

Массовую долю i-го компонента  в анализируемой пробе Xi пр, [мг/кг] рассчитывают по формуле:

Xi =	Cicp · V1 · V3 · K2	(2)
	K1 · mпр · V2

 

где:Сiср – среднее значение массовой концентрации i-го компонента в пробе, введенной в хроматограф [г/дм3];

mпр – масса пробы продукта, [г];

V1 – объём гидролизата [см3];

V2 – объём гидролизата, взятого на анализ, до разбавления водой (V2 = 8 см3);

V3 – объём элюата;

K1 – коэффициент, учитывающей выход реакции гидролиза и степень извлечения витаминов из пробы (см. таблицу);

K2 – коэффициент различия процедур подготовки к анализу градуировочных растворов и проб, рассчитанный по формуле:

 

K2	=	Vгр1	·	Vгр3	(3)
		V1		V3

 

где:Vгр1 – объем гидролизата градуировочных растворов [см3];

Vгр3 – объем элюата при ТФЭ градуировочных растворов.

После сокращений расчётная формула принимает вид:

Xi =	Cicp · Vгр1 · Vгр3	(4)
	K1 · mпр · V2

 

Коэффициент K1, учитывающий выход реакции гидролиза и степень извлечения витаминов из пробы для различных видов продуктов (эмпирические данные) представлен в таблице 2.

Талица 2- Значение коэффициента K1 для различных видов продуктов

Коэффициент  K1	Мука, хлеб,  макаронные  изделия	Премиксы, БАД,  детское питание	Масложировая  продукция
Витамин А	0,90	0,98	0,90
Витамин Е	0,70	0,98	0,65
Витамин D3	0,90	0,98	0,80

За результат измерений принимают среднее арифметическое значение массовой доли i-го компонента  в двух параллельных пробах.

 

3.2 Определение содержания жирорастворимых витаминов

 

Витами́ны — группа низкомолекулярных органических соединений относительно простого строения и разнообразной химической природы. Это сборная по химической природе группа органических веществ, объединённая по признаку абсолютной необходимости их для гетеротрофного организма в качестве составной части пищи. Автотрофные организмы также нуждаются в витаминах, получая их либо путем синтеза, либо из окружающей среды. Так, витамины входят в состав питательных сред для выращивания организмов фитопланктона. Витамины содержатся в пище (или в окружающей среде) в очень малых количествах, и поэтому относятся к микронутриентам.

Данный методика устанавливает метод измерения массовой доли жирорастворимых витаминов A (ретинола и его сложноэфирных форм), Е (α-токоферола и его сложноэфирных форм) и D3 (холекальциферола) в продуктах детского питания методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для определения содержания жиросодержащих витаминов была подготовлена проба к анализу. В качестве примера используются, два  образца детского питания: детская молочная смесь «Малютка» от 0 до 6 месяцев и детская молочная смесь «Малютка» от 6 до 12 месяцев.

Подготовка проб к измерениям включает следующие этапы:

• щелочной гидролиз пробы продукта и извлечение из пробы витаминов;
• очистка гидролизата и концентрирование витаминов из пробы методом твердофазной экстракции;
• подготовка пробы для ввода в жидкостный хроматограф.

Рисунок 4 - Блок-схема процедуры пробоподготовки

Величина навески зависит от большего или меньшего содержания витаминов. Поэтому берут до 50 г сухого продукта.

Для хроматографического определения жирорастворимых витаминов A, E и D3 необходимо использовать градиентную ЖХ-систему с спектрофотометрическим детектором, позволяющим изменение длины волны источника света в процессе анализа, и термостатом колонок.

Данный метод основан на осветлении пробы ферментативным гидролизом или растворами Карреза; экстракции патулина из пробы этилацетатом; очистке органического экстракта водным раствором карбоната натрия (при необходимости – дополнительной очистке экстракта методом твердофазной экстракции) и определении витаминов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с фотометрическим спектрофотометрическим детектированием.

Для проведения анализа предварительно готовят градуировочные растворы  A, E и D3; проводят пробоподготовку; подготавливают к работе прибор.

В данном методе используется следующее оборудование:

• хроматограф жидкостный с спектрофотометрическим детектором;
• термостат колонок;
• персональный компьютер с установленным программным обеспечением

Условия использования метода жидкостной хроматографии:

• градиентный режим разделения;
• подвижная фаза: ацетонитрил (элюент А) – дихлорметан (элюент В);
• программа градиентного элюирования:
• начало A=100% B=0%;
• градиент A=90% B=10% за 8 мин;
• градиент A=70% B=30% за 2 мин;
• изократика A=70% B=30% 10 мин;
• градиент A=100% B=0% за 3 мин;
• изократика A=100% B=0%
• колонка;
• защитная колонка;
• скорость потока: 1,0 см3/мин;
• объем петлевого дозатора: 20 мкл;
• температура: комнатная;
• детектирование: спектрофотометрическое при смене длины волны источника света во время анализа
• 0 мин - длина волны 436 нм,
• 10 мин - длина волны 280 нм,
• 27 мин - длина волны 436 нм.

Градуировку во всем диапазоне измеряемых концентраций проводят не реже 1 раза в месяц, а также при смене колонки и/или защитной колонки, при замене веществ и/или реактивов; после проведения ремонта хроматографа, после длительного простоя хроматографа (2 недели и более), при изменении эффективности хроматографической системы или чувствительности детектора.

Сбор,  обработку  и  вывод  данных  осуществляют  с  помощью  персонального  компьютера  с операционной системой «Windows XP», на котором установлена программа сбора и обработки хроматографических данных для «Windows XP».

Хроматограмма анализа детской молочной смеси «Малютка» от 0 до 6 месяцев представлена на рисунке 5

          

Рисунок 5 - Смесь жирорастворимых витаминов в образце № 1

Хроматограмма  анализа детской молочной смеси «Малютка» от 6  до 12 месяцев представлена на рисунке 6

Рисунок 5 - Смесь жирорастворимых витаминов образце № 2

Из представленных хроматограмм видно, что содержание жирорастворимых витаминов в детской молочной смеси «Малютка» от 6 до 12 месяцев больше, чем содержание жирорастворимых витаминов в детской молочной смеси «Малютка» от 0 до 6.

 

        

 

 

 

Заключение

 

Жидкостная хроматография важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии. Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов, белков, ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, гормонов и других химических веществ; изучения процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов; диагностики в медицине; анализа продуктов химического и нефтехимического синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод; изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности химических процессов.

Жидкостная хроматография - это целая группа методов разделения, в которых происходит распределение соединений между подвижной жидкой фазой и стационарной фазой с большой удельной поверхностью, над которой перемещается жидкая фаза. Жидкостная хроматография может быть осуществлена в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Жидкостная хроматография широко применяется в лабораториях и в промышленности для качественного и количественного анализа, контроля производства, особенно в связи с автоматизацией многих процессов, а также для препаративного выделения индивидуальных веществ (например, благородных металлов), разделения редких и рассеянных элементов. Жидкостная хроматография может быть осуществляется в виде хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В некоторых случаях для идентификации веществ используется жидкостная хроматография в сочетании с другими физико-химическими и физическими методами, например с масс-спектрометрией, ИК-, УФ-спектроскопией и др. Для расшифровки хроматограмм и выбора условий опыта применяют ЭВМ. Основные достоинства жидкостного хроматографического анализа:

• экспрессность; высокая эффективность; возможность автоматизации и получение объективной информации;
• сочетание с другими физико-химическими методами;
• широкий интервал концентраций соединений;
• возможность изучения физико-химических свойств соединений;
• осуществление проведения качественного и количественного анализа;
• применение для контроля и автоматического регулирования технологических процессов.