Микробиологический анализ напитков

Емкости для хранения квасного сусла при настойном способе производства кваса и бродильно-купажные аппараты при производстве кваса из концентрата квасного сусла после освобождения и перед приемкой новой партии сырья промывают горячей водой, дезинфицируют и ополаскивают многократно водой.

Помещения для разведения чистых культур дрожжей и молочнокислых бактерий перед началом работы подвергают влажной уборке и применяют бактерицидные лампы для обеззараживания воздуха. Все емкости для разведения чистых культур стерилизуют паром.

На  предприятиях безалкогольной промышленности кроме ежедневной должна проводиться  общая дезинфекция помещений, оборудования с остановкой всего производства.

Общая дезинфекция проводится еженедельно. При общей дезинфекции купажеры после мойки заполняют дезинфицирующим раствором, который пропускают через все трубопроводы, дозировочные и разливочные автоматы и выдерживают в них до 2 ч. После спуска дезинфицирующего раствора всю систему промывают водой. Последнюю смывную воду подвергают микробиологическому анализу на общее содержание в ней микроорганизмов и определяют коли-титр. Эти показатели должны быть близкими к показателям питьевой водопроводной воды, используемой для обработки оборудования. 

2. Собственные исследования

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Отбор проб для микробиологического анализа.

Перед отбором проб визуально определяют внешний вид упаковочных единиц.

Пробы продуктов для микробиологических анализов отбирают до отбора проб для  физико-химических и органолептических  анализов.

Пробы продуктов для микробиологических анализов отбирают в стерильную посуду, горло которой предварительно обжигают в пламени горелки. Пробы отбирают с помощью стерильных инструментов.

Каждую бутылку с пробой снабжают этикеткой, на которой должны быть указаны: наименование предприятия-изготовителя, наименование пива, дата розлива, дата отбора пробы, количество пива от которого отобрана проба, фамилии и должности  лиц, отобравших пробу.

До проведения анализа  бутылки с пробой должны храниться  при температуре от 0 до 5^О С не более 24 часов.

2.1.2 Подготовка проб для микробиологического анализа.

Упаковку пробы осматривают  и устанавливают соответствие надписи  на литографическом оттиске или  этикетке, указанной в сопроводительном документе.

Упаковку с пробой очищают  от загрязнений. Если на анализ поступили  герметично укупоренные пробы продукта, то проверяют герметичность тары.

Микробиологический анализ нормальных по внешнему виду проб продукта проводят в боксе с соблюдением  условий асептики.

Перед взятием пробы готового напитка пробку и горловину бутылки, поверхность металлической банки  или другой упаковки протирают ватным тампоном, смоченным в 70%-м растворе этилового спирта. Затем стерильным ключом быстро снимают корнепробку или пробку бутылки отвинчивают. Горловину открытой бутылки обжигают в пламени спиртовки или протирают 70%-м раствором этилового спирта и отбирают необходимый для анализа объем напитка.(30712)

2.1.3 Посев методом мембранных фильтров

100 мл пива из каждой упаковки пропускают через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 нм. Фильтры промывают стерильной дистиллированной водой для удаления остатков пива, разрезают на 2 половинки, каждую половинку помещают на чашку Петри диаметром 5 см, предварительно залитой средой сусло-агар или универсальным пивным агаром. Одну половинку фильтра помещают в анаэробные условия на 11 дней при температуре 25^ОС, другую половинку в аэробные условия на 3 дня при температуре 25^ОС. Выросшие колонии делят на бактериальные, дрожжевые, плесневые. Бактериальные подвергаются каталазному тесту для выделения лактобацилл и педиококков. Результаты полученные на каждой половинке фильтра умножают на два для получения общего количества в 100 мл.

2.1.4 Определение количества мезофильных  аэробных и факультативно-анаэробных  микроорганизмов

Метод основан на высеве продукта в агаризованную питательную среду, инкубировании посевов, подсчете всех выросших видимых колоний.

При определении количества микроорганизмов посевом в агаризованные  питательные среды из продукта по 1 см³ высевают в две параллельные чашки Петри. Посевы заливают расплавленной и охлажденной до 45-48^ОС питательной средой.

Посевы инкубируют при  температуре (30±1) ^ОС в течение (72±3) ч. Чашки Петри с посевами распределяют в термостате таким образом, чтобы расстояние между стопками чашек и стенками термостата было не менее 3 см.

Количество выросших колоний  подсчитывают на каждой чашке Петри, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением  в 4-10 раз. Каждую подсчитанную колонию  отмечают на дне чашки чернилами. Для подсчета отбирают чашки, на которых  выросло от 15 до 300 колоний.

При большом количестве колоний  и равномерном их распределении  дно чашки Петри делят на 4 и  более одинаковых секторов, подсчитывают чисто колоний на 2-3 секторах (но не менее чем на 1\3 поверхности чашки), находят среднеарифметическое значение числа колоний и умножают на общее количество секторов всей чашки. Таким образом, находят общее число колоний в посевах одного разведения.

Количество микроорганизмов  в 1,0 г (см³) продукта М вычисляют по формуле:

М=N÷m×C, где N – степень разведения навески; m – количество инокулята, внесенное в чашку Петри, см³; C – округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Количество мезофильных  аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) выражается КОЕ/см³ или КОЕ/г, глее КОЕ – колонеобразующая единица.

2.1.5 Определение бактерий группы  кишечных палочек (колиморфных  бактерий)

Метод основан на выявлении  бактерий группы кишечных палочек (колиморфных  бактерий) по сбраживанию лактозы  с образованием кислоты и газа при (36±1)^ОС в течение 24 часов. К бактериям группы кишечных палочек относятся грамотрицательные, бесспоровые палочки, принадлежащие к родам Echerichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella/ Serratia (т.е. как цитратотрицательные, так и цитратположительные представители энтеробактерий).

Определение БГКП (колиморфных  бактерий) проводят методом мембранной фильтрации или прямым посевом в  питательную среду.

Метод мембранной фильтрации основан на фильтровании нормируемого объема продукта через мембранный фильтр, инкубировании посевов на агаризованной  селективной среде с лактозой и последующей идентификации  колоний по культуральным и биохимическим  признакам.

Метод прямого посева основан  на накоплении бактерий посевом нормируемого объема или его разведения в жидкую селективную среду с лактозой, инкубировании, пересеве, при необходимости, на агаризованную селективную среду  с лактозой и идентификации колоний  по культуральным и биохимическим  признакам.

Методом прямого посева, посев проводят в жидкую селективную  среду Кесслер с лактозой. Соотношение  между количеством высеваемого  продукта и питательной средой 1:9, а для среды двойной концентрации 1:1.

Перед посевом пива в среду  Кесслер его освобождают от двуокиси углерода и нейтральзуют стелильным раствором гидроокиси натрия для предотвращения резкого снижения рН среды Кесслер (на 0,5 и более).

Значение рН среда Кесслер  при посеве в нее продукта доводят до допустимых значений стерильным раствором гидроокиси натрия или при приготовлении среды рН устанавливают выше заданного с учетом его последующего значения при внесении продукта. Количество добавляемого раствора гидроокиси натрия или величину, на которую необходимо увеличить рН при приготовлении питательной среды, устанавливают опытным путем.

Нормируемый объем пробы  пива (1см³) засевают в среду Кесслер с лактозой двойной концентрации, разлитую по 9 см³ в пробирки с поплавком.

Посевы на средах Эндо и  Кесслер инкубируют при температуре (36±1)^ОС в течение 24-48 часов. Чашки Петри с посевами инкубируют дном верх. Посевы просматривают через (24±3) часа, отмечают положительные результаты посевов в среду Кесслер, а окончательный учет проводят через (48±3) часа.

Положительными результатами посева в среду Кесслер считают  посевы, в которых имеет место  интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении  среды, образовании газа.

Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на среде  Кесслер к колиформным бактериям  делают пересевы на поверхность среды  Эндо. Посевы инкубируют при температуре (36±1)^ОС в течение (24±3) часа.

Посевы на среде Эндо после  инкубирования просматривают и  отмечают рост типичных колоний для  бактерий группы кишечных палочек (колиморфных  бактерий) – красных с металлическим  блеском или без него, розовых  и бледно-розовых. Типичные колония  для колиморфных бактерий имеют  отпечаток на обратной стороне фильтра  или на среде Эндо после снятия петлей колонии.

При необходимости подтверждения  принадлежности выросших колоний микроорганизмов  на среде Эндо к колиформным бактериям  из колоний приготовляют препараты, окрашивают по Граму и микроскопируют.

При отсутствии на среде  Эндо колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек или отсутствии признаков роста на среде Кесслер  с лактозой (отсутствие газа в поплавке или помутнения среды) дают заключение об отсутствии БГКП и о соответствии исследуемого продукта микробиологической норме.

При образовании помутнения и газа в среде Кесслер и роста на среде Эндо типичных для колиформных бактерий колоний и последующей идентификации – обнаружение грамотрицательных, не содержащих спор палочек, указывает на наличие БГКП (колиформных бактерий) в анализируемом объеме продукта и несоответствие его биологической норме.

При обнаружении БГКП только в одной из повторностей, - анализ следует повторить. Если БГКП будут  вновь обнаружены в одной из повторностей, то это свидетельствует о несоответствии продукта микробиологической норме.

2.1.6 Определение дрожжей и плесневых  грибов.

Метод основан на посеве определенных количеств продукта на/в  селективные среды, культивировании  посевов, подсчете всех видимых колоний дрожжей и плесневых грибов, типичных по макро- и (или) микроскопической морфологии. 
Определение количества дрожжей и плесневых грибов в продуктах проводят глубинным или поверхностным методом, а так же с применением мембранной фильтрации.

Пробы продукта в количестве 1 см³ высевают параллельно в две чашки Петри. Посевы заливают расплавленной и охлажденной до 45-48^ОС средой.

Чашки с посевами выдерживают  в термостате при температуре (24±1)^ОС в течение 5 сут. с предварительным учетом выросших колоний через 2 сут.

Через 2 сут. термостатирования проводят учет типичных колоний, а через 5 сут. – окончательный, наблюдая за ростом дрожжей и плесневых грибов визуально, а при необходимости просматривают микроскопический препарат.

Рост дрожжей на питательной  среде сопровождается образованием крупных, выпуклых, матово-блестящих, плотных  с ровными краями серовато-белых  колоний.

Развитие плесневых грибов на среде сопровождается образованием пушистого мицелия различной  окраски (белой, черной, зеленоватой).

При необходимости для  разделения колоний дрожжей и  плесневых грибов проводят микроскопическое исследование. Для этого из отдельной  колонии готовят препараты методом  раздавленной капли. Дрожжевые клетки – круглой, овальной или продолговатой  формы, часто почкующиеся, длиной от 2,5 до 30 мкм, шириной 2,5 до 10 мкм. Плесневые  грибы состоят из нитей – гифов, без перегородок или септированных на клетки. Гифы образуют боковые выросты и разветвления.

В посевах при определении  количества дрожжей и плесневых  грибов колонии (при необходимости подтвержденные микроскопированием) подсчитывают отдельно, пользуясь лупой с увеличением в 4-10^х. Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 50 колоний дрожжей. Колонии подсчитывают в каждом из параллельных посевов и находят среднеарифметическое значение числа колоний. Результаты записывают в следующем виде: дрожжи КОЕ/см3 (г) нормируемого объема; плесневые грибы КОЕ/см3 (г) нормируемого объема.

2.1.7 Выявление бактерий рода Salmonella

Навеску продукта, в объеме которой предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonella, высевают в забуференную пептонную воду. Соотношение объема продукта и забуференной пептонной воды 1:9.

Доведение рН проводят асептически  с помощью стерильных растворов  гидроксида натрия и соляной кислоты. Количество добавляемого раствора гидроксида натрия устанавливается опытным  путем.

Посевы инкубируют при  температуре (36±1)^ОС в течение 18-20 ч.

Культуры, полученные после  инкубирования высевают в две  среды для селективного обогащения. Для этого по 10 см³ культуры переносят в 100см³ селенитовой среды, и в 100см³ тетратионатной среды.