Определение суммарного содержания полифенольных веществ в коньяке

Антимутагенная  активностью полифенолов винограда

Полифенолы  винограда обладают также антимутагенной активностью (проантоцианидины), бактерицидным  действием (мальвидол, р-кумаровая кислота), антивирусным эффектом (таннин). Таким образом, можно констатировать, что суммарные полифенолы винограда обладают широкой биологической активностью (Огай Ю.А. и др., 2000; Авидзба А.М.и др., 2001; Fontecave M et al., 1998). Сравнительно низкая токсичность флавоноидных соединений, наряду с их избирательным фармакологическим действием на организм человека, позволяет все шире привлекать эту группу соединений как для создания новых лекарственных фармацевтических средств, так и для проявления их влияния в составе продуктов питания.

 

 

 

2. Эксперементальная часть

2.1 Методы определения антиоксидантной активности пищевых продуктов

 

      Антиоксидантная активность – комплексный показатель, отражающий суммарное содержание и действие присутствующих в объекте восстановителей.   

К антиоксидантам, обрывающим цепи окисления за счет взаимодействия с пероксидными радикалами,

относятся соединения с функциональной группой, содержащей подвижный атом водорода OH; NH ; SH. Можно предположить, что антиоксиданты в экстрактах из растительного сырья представлены преимущественно фенольными и полифенольными соединениями. Общеизвестно, что фенольные группы в полифенольных и других сложных молекулах и ассоциатах образуют внутримолекулярные и межмолекулярные водородные связи, не позволяющие реакционным центрам участвовать в процессах ингибированного окисления.

      За прошедшее десятилетие предложено много методов определения антиоксидантной активности, предложены новые реагенты, модельные системы и приборы. Среди электрохимических методов и устройств следует выделить вольтамперометрический с ртутнопленочным рабочим электродом, реализованный в вольтамперометрическом анализаторе ТА-2 ("Техномет",     г. Томск). Предложен метод одновременного определения общего полифе-нольного индекса и общего антоцианового индекса с использованием инжекционно-проточной установки и спектрофотометрическим детектиро-ванием на двух длинах волн 280 и 520 нм. Определение антиоксидантной активности фенольных соединений (оксикислот, флавоноидов, токоферолов) методом ВЭЖХ с кулонометрическим детектором. Показано, чем меньше потенциал окисления фенольных соединений, тем больше его антиоксидантная активность [20].

Все существующие методы определения антиоксидантной  активности винодельческой продукции  можно разделить на прямые и косвенные  методы.

Прямые методы основаны на детекции поглощения генерируемых в среду свободных радикалов, при этом детекция и генерация могут осуществляться различными способами:

– методы дифференциальной импульсивной полярографии;

– спектрофотометрические методы;

– хемилюминесцентный анализ.

– метод фирмы RANDOX;

– метод профессора В. А. Рогинского.

Косвенные методы основаны на определении некоторых  физико-химических параметров вина:

– общее содержание фенольных соединений;

– спектры  поглощения;

– концентрация растворенного кислорода;

– концентрация SO2;

– pH;

– окислительно – восстановительный потенциал.

В последнее время для  оценки антиоксидантного статуса значительно  возрос интерес к применению различных  электрохимических методов. Это  связано с высокой чувствительностью, быстротой анализа данной группы методов и отсутствие влияния цвета образцов на результаты анализа.

Оценку антиоксидантной  активности некоторых пищевых продуктов  проводят методом потенциометрии основанном на использование свойства веществ-антиоксидантов участвовать в окислительно-восстановительных реакциях за счет енольных (-ОН) и сульфгидрильных (-SH) групп. Определение антиоксидантных свойств растворов основано на химическом взаимодействии антиоксидантов с медиаторной системой Меox/Меred, которое приводит к изменению ее окислительно-восстановительного потенциала.

Амперометрический способ определения антиоксидантной активности основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении  исследуемого вещества на поверхности  рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом. Чувствительность амперометрического способа определяется как природой рабочего электрода, так и потенциалом приложенным к нему. Предел обнаружения амперометрического детектора полифенолов, флавоноидов на уровне нано-пикограммов(10-9 – 10-12 г), при таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма.

Существуют также методы ORAC (oxygen radical absorbance capacity), TRAP (total radical trapping antioxidant parameter), FRAP (ferric reducing power), ABTS (2,2 – azunobis (3 – ethylbenzthiazoline) – 6- sulfonic acid), TBARS (thiobarbituric acid reactive substance). В этих методах антиоксидантная активность — функция многих параметров, в частности времени, температуры, природы вещества, концентрации антиоксиданта и других соединений. Поэтому данные одних методов не коррелируются с данными других методов.

Разработан  новый метод измерения антиоксидантной  активности вин, основанный на применении N,N-диметил-р-фенилендиамина. Метод является быстрым, недорогим и обеспечивает высокую точность и воспроизводимость полученных результатов антиоксидантной активности вин четко коррели-рованна с содержанием в них фенольных веществ .

Более экспрессно оценить содержание фенольных и фурановых веществ в коньяках и коньячных спиртах позволяет применение спектрофотомерии УФ и видимого диапазона. Полифенольные соединения имеют максимум поглощения на длине волны 280 нм, тогда как придающие цвет коньяку вещества регистрируют в области 420 нм. Компоненты сахарного колера, добавляемого в коньяк по рецептуре, содержат большое количество фурановых компонентов, которые также имеют максимум поглощения в области 280 нм. В выдержанных коньячных спиртах, не содержащих колер, оптическая плотность формируется только за счет присутствия полифенольных соединений, переходящих в коньячный спирт из дубовой древесины. В коньяках оптическая плотность (при 280 нм) есть результат суммарного вклада полифенольных соединений древесины дуба и компонентов колера.

В выдержанных  коньячных спиртах, не содержащих колер, оптическая плотность формируется только за счет присутствия полифенольных соединений, переходящих в коньячный спирт из дубовой древесины. В ординарных коньяках оптическая плотность образуется из суммы полифенольных соединений древесины дуба и компонентов колера. Из этого следует, что по мере созревания увеличивается интенсивность окраски и, как следствие, светопоглощение готового

продукта .

 

 Исходные реактивы, материалы и используемая аппаратура

 

Фотоэлектроколориметр КФК-2МП.

Спектрофотометр Agilent 8453

Стеклянные  кюветы номинальной толщиной поглощающего слоя 20 мм по ГОСТ 12083-78.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919-83.

Весы лабораторные ВЛР-200, 2 класса точности ТУ 25-06-1131-75.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 250 и 500 см3, 2 класса точности по ГОСТ 1770-74.

Пипетки  вместимостью 1, 2, 5, 10, см3  2 класса точности по ГОСТ 20292-74.

Бутылки стеклянные вместимостью 100, 250 и 500 см3.

Стаканы химические вместимостью 50 и 100 см3 по ГОСТ 1770-74.

Железоаммонийные  квасцы по ТУ 6-09-53559-97.

о-фенантролин, имп.

Катехол

Кислота аскорбиновая, имп.

Кислота галловая, имп.

Кверцетин по ТУ 6-09-10-745-78.

Рутин

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962-67.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

2.2 Методика определения антиоксидантной  активности

2.2.1 Приготовление рабочих растворов

2.2.1.1 Приготовление 0,2 % спиртового раствора о-фенантролина

 

На аналитических весах взвешивают 0,1980 г о-фенантролина с погрешностью 0,00025 г, переносят в термостойкий стакан вместимостью 100 см³, добавляют 30-40 см³ дистиллированной воды и растворяют при слабом нагревании. Взвешивают 0,2892 г железоаммонийных квасцов с погрешностью 0,00025 г переносят в термостойкий стакан  вместимостью 100 см³, добавляют 2 см³ солянной кислоты с концентрацией 1 моль/дм³, растворяют при слабом нагревании в 30-40 см³ дистиллированной воды.

Полученные  растворы переносят в колбу вместимостью 100 см³ и доводят до метки дистиллированной водой.

 

2.2.1.2 Приготовление стандартного раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 1,0 г/дм³

 

На аналитических  весах взвешивают 0,1000 г аскорбиновой кислоты с погрешностью 0,00025 г, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

 

2.2.1.3 Приготовление рабочего раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 0,1 г/дм³

 

Раствор аскорбиновой кислоты концентрацией 0,1 г/дм³ готовят разбавлением стандартного раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 1,0 г/дм³ в колбе вместимостью 100 см³.

         2.2.1.4 Приготовление стандартного раствора галловой кислоты с концентрацией 1,0 г/дм³

 

На аналитических  весах взвешивают 0,1000 г галловой кислоты с погрешностью 0,00025 г, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

 

 

2.2.1.5 Приготовление раствора фтористого натрия концентрацией 0.5 моль/дм³

5.2475 г фтористого натрия  помещают в мерную колбу вместимостью 250 см³ и доводят объем до метки дистиллированной водой.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.2.2 Построение градуировочного  графика

В мерные колбы  вместимостью 100 см³ помещают по 1 см³ 0,2 % спиртового раствора о-фенантролина и раствора железа(III) с концентрацией 0,5 г/дм³, и добавляют 0,0; 0,2; 0,4; 0,8 см³ рабочего раствора вещества стандарта (аскорбиновой кислоты) ; 0,0; 0,1; 0,2; 0,4 см³ (галловой кислоты), доводят объем до метки дистиллированной водой. Растворы перемешивают. Содержание аскорбиновой кислоты в растворах равно соответственно 0; 0,02; 0,04; 0,08; мг или 0; 2; 4; 8 мкг галловой кислоты. . Через 60 мин прибавляют 2 см³ 0.5 М фтористого натрия. Через 30 и 60 мин измеряют оптическую плотность при λ=490 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 20 мм относительно дистиллированной воды.

Строят график зависимости  оптической плотности от количества вещества стандарта. Полученные результаты обрабатывают методом наименьших квадратов.

АК			ГК
0,2	0,065		0,1	0,108
0,4	0,199		0,2	0,199
0,8	0,268		0,4	0,331

 

 

 

 

2.2.3 Выполнение анализа

 

Неразбавленную пробу  объёмом 0.1 мл/см³ или разбавленную в соотношении 1:2 (0.2 мл) дистиллированной водой, объемом переносят в мерную колбу вместимостью 100 (50) см³, прибавляют 1(0,5) см³ комплексного реагента и доводят объем до метки дистиллированной водой. Через 60 мин прибавляют 2 (1) см³ 0,5 М фтористого натрия, и по истечению 60 мин измеряют оптическую плотность при λ=490 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 20 мм относительно дистиллированной воды.

Строят график зависимости оптической плотности от времени. Полученные результаты обрабатывают методом наименьших квадратов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

коньяк	V,мл	А
	конц.	конц.	разб.
№19Кен.4года	0,2\50	0,21	0
		0,206	0
		0,209	0
№14Кен.5лет	0,2\50		0
		0,187	0
		0,193	0
		0,206	0
Кен.6лет	0,2\50	0,149	0
		0,143	0
		0,146	0
		0,148	0
№15Нов.10лет	100	0,174
			0,175
		0,178	0,181
№24Нов.10лет	100	0,202
		0,199	0,201
		0,203
№23Нов.8лет	100	0,163	0,153
		0,155	0,162
№22Нов.5лет	100	0,198	0,187
		0,207	0,195
№21Нов.4 года	100	0,16	0,164
			0,16
			0,163
№20Нов.3года	100	0,143	0,143
		0,143	0,139