Виды хромотографии

 ВВЕДЕНИЕ

   Хроматография [гр. сhrömatos − цвет + graphö − пишу] — метод разделения, анализа и физико-химических исследований веществ, основанный на перемещении зоны вещества вдоль слоя сорбента в потоке подвижной фазы с многократным повторением сорбционных и десорбционных актов. При этом разделяемые вещества распределяются между двумя несмешивающимися фазами (в зависимости от их относительной растворимости в каждой фазе): подвижной и неподвижной.

 
Цвет М.С. (1872-1919 г.г.)

  Впервые термин "хроматография" был использова российским биологом Михаилом Семеновичем  Цветом для описания разработанного им метода разделения компонентов хлорофила  на бумаге. Это произошло 21 марта  1903 г ., когда  Михаил Семенович Цвет, в то время работавший в должности ассистента (официально - в должности внештатного лаборанта) кафедры анатомии и физиологии растений Варшавского университета, прочитал свой знаменательный доклад "О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биологическому анализу" (Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Отд. биологии. 1903. Т. 14. С. 1-20). Эксперименты в области адсорбции, приведшие в итоге к открытию хроматографии, ученый начал двумя годами раньше - в возрасте 28 лет. Подробное изложение принципов и возможностей своего хроматографического метода он дал в 1906 г . в двух статьях на немецком языке и в книге 1910 г . "Хромофиллы в растительном и животном мире".

По  экспертным оценкам, хроматография  относится к 20 выдающимся открытиям  прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а  через нее определили уровень  развития техники и промышленности, цивилизации в целом. Хотя по образованию  и роду занятий Цвет был ботаником, результаты его открытия столь значимы  для всех естественных наук, что  Федерация европейских химических обществ, например, приводит имя Цвета, наряду с четырьмя другими русскими именами - Ломоносова, Менделеева, Бутлерова  и Семенова, - в числе ста выдающихся химиков прошлого.

1. В конце своего 100-летия хроматография представляет собой:

2. самый распространенный и совершенный метод разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц;

3. уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей:

4. самостоятельное научное направление и важный физико-химический метод исследования и измерения;

5. препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом виде;

6. мощную отрасль научного приборостроения.

   Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены, количественно и качественно определены более 1000 индивидуальных компонентов, например, в бензиновых фракциях нефти; двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биологических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стала возможной расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе "Геном человека". Используя хроматографию, можно определить содержание супертоксикантов, в частности, полихлорированных диоксинов в объектах окружающей среды при крайне низких концентрациях этих веществ (10-10%).

   Хроматография изучает термодинамику состояния двухфазных систем газ-жидкость, жидкость-жидкость, жидкость-твердое тело, сверхкритическое и жидкокристаллическое состояние веществ, исследует природу межмолекулярных взаимодействий, кинетику процессов внутреннего и межфазного массообмена, процессы комплексообразования, ассоциации и образования соединений включения, стереохимию органических соединений и многое другое.

   В связи с исключительной многогранностью понятия "хроматография" оно не может быть охвачено одним единственным определением. В категориях "явление, процесс, метод, наука" хроматографию предложено определять как явление образования, движения и изменения концентрационных зон веществ (частиц) в условиях массообмена между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами или на границе раздела этих фаз;

процесс дифференцированного многократного  перераспределения веществ или  частиц между несмешивающимися и  движущимися относительно друг друга  фазами, приводящий к обособлении) концентрационных зон индивидуальных компонентов исходных смесей этих веществ или частиц; метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз; наука о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

    В научной литературе встречаются и другие определения хроматографии, однако любое из них должно обязательно содержать среди отличительных видовых признаков упоминание о переносе веществ (частиц) в системе несмешивающихся и движущихся друг относительно друга фаз. Наличие как минимум двух фаз и их относительное движение, то есть динамика процесса, -неотъемлемые признаки хроматографии.

     В общем случае хроматография это наука о принципах и методах разделения, количественного и качественного определения веществ, используя их различия (размер, заряд, массу, полярность и т.д.) в потоке на границе нескольких гетерогенных сред (газ и твердое тело, жидкость и твердое тело, газ и жидкость, несмешиващиеся жидкости и т.д.).

1.  Жидкостная адсорбционная хроматография

     До конца 50-х годов XX в. практическое значение жидкостной адсорбционной хроматографии было сравнительно невелико и ее развитие происходило медленно. Однако с появлением в конце 50-х годов высокочувствительных методов детектирования и новых селективных адсорбентов на основе полимеров жидкостная адсорбционная хроматография стала высокочувствительным и селективным методом анализа многокомпонентных смесей в растворах. Бе практическое значение возросло еще больше, когда стали применять высокие давления.

     Теоретические основы жидкостной хроматографии

Жидкостная адсорбционная хроматография  основана на теории адсорбции из раствора. Адсорбционное равновесие между раствором и адсорбентом подчиняется уравнению изотермы адсорбции Лэнгмюра (1), в области разбавленных растворов изотерма линейна (2). Селективность адсорбции зависит от природы сил взаимодействия между адсорбирующимся веществом и адсорбентом. Эффективность хроматографической колонки зависит главным образом от процессов диффузии и массопередачи в обеих фазах и определяется, как и в газовой хроматографии, высотой Н эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ). С линей-ной скоростью подвижной фазы 17 и некоторыми другими величинами ВЭТТ связана уравнением

                                                          Н = 2(1-U (1)

Причем                                            = 

где — среднее время между десорбцией и повторной адсорбцией молекулы вещества, когда она движется со скоростью подвижной фазы U; — среднее время пребывания молекулы в неподвижной фазе.

    Уравнение (1) показывает, что с ростом линейной скорости движения подвижной фазы ВЭТТ возрастает и, следовательно, эффективность колонки падает. Зависимость ВЭТТ от имеет довольно сложный характер, но хотя с ростом величина уменьшается, ВЭТТ может расти, так как входит в уравнение (1) в качестве множителя.

    Время пребывания молекулы в неподвижной фазе связано с глубиной пор d и коэффициентом диффузии D уравнением  Эйнштейна: 

                                               2D (2)

Чем больше d, тем больше Н и, следовательно, меньше эффективность колонки. Большая глубина пор у адсорбентов классической жидкостной адсорбционной хроматографии была одной из основных причин ее низкой эффективности.

    В современной хроматографии широко применяются поверхностно-пористые адсорбенты (ППА). Это твердые, не обладающие пористостью сферические зерна, на поверхность которых нанесен тонкий слой адсорбента с высокой пористостью толщиной примерно 1 мкм. У этих адсорбентов нет глубоких пор, что приводит к уменьшению Н и значительному увеличению эффективности колонки. Применение поверхностно-пористых адсорбентов позволило также значительно повысить скорость жидкостной адсорбционной хроматографии.

В последнее время большой интерес  вызывает жидкостная хроматография  при высоких давлениях, позволяющая  проводить сложные разделения. Этот метод получил название высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

     Жидкостная хроматография применяется как аналитическая и препаративная. В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используют колонки диаметром до 5 мм, плотно упакованные сорбентом с частицами малого размера (3-10 мкм); давление для прокачивания элюента до 3.10⁷ Па (ее называют также хроматографией высокого давления). Варианты ВЭЖХ - микроколоночная хроматография на наполненных колонках малого диаметра и капиллярная хроматография на полых и наполненных сорбентом капиллярных колонках. К жидкостной хроматографии обычно относят также гидродинамическую хроматографию, где неподвижная фаза отсутствует.

    По механизму удерживания разделяемых веществ неподвижной фазой Жидкостная хроматография делится на осадочную хроматографию, адсорбционную, распределительную, ионообменную хроматографию (в т. ч. ионную хроматографию), ион-парную, лигандообменную, эксклюзионную (ситовую) и аффинную хроматографию (биоспецифическую)

1.1 Основные узлы приборов жидкостной хроматографии

     Как и в газовой, в жидкостной адсорбционной хроматографии основными узлами хроматографической установки являются колонка, дозатор и детектор.

Колонки и дозаторы, Выбор оптимальных  длины и внутреннего диаметра колонки является компромиссным, так как приходится учитывать селективность и эффективность колонки, длительность анализа, удобство работы и другие факторы. Учитывается, например, что критерий разделения увеличивается пропорционально лишь корню квадратному из длины колонки, а продолжительность анализа пропорциональна ее длине. Уменьшение диаметра колонки вызывает трудности ее заполнения, а увеличение диаметра приводит к уменьшению скорости движения подвижной фазы. В жидкостной адсорбционной хроматографии используются колонки длиной от 15—20 см до 1,5—2,0 м и не более 10 м с внутренним диаметром 1—6 мм и не более 12 мм. Изготовляются колонки из толстостенного стекла или нержавеющей стали и плотно и равномерно заполняются адсорбентом. При плотном заполнении создаются условия для более постоянной скорости потока жидкости.

     К адсорбентам в современной жидкостной адсорбционной хроматографии предъявляются требования не только селективности и эффективности, но и высокой скорости хроматографирования, что определяется, главным образом, структурой поверхности. Отличными структурными свойствами обладают поверхностно-пористые адсорбенты (ППА), у которых большая механическая прочность и отсутствуют глубокие поры. В качестве активного слоя на поверхность стеклянных шариков в ППА наносят силикагель, оксид алюминия или некоторые полимеры. Для современной высокоскоростной жидкостной адсорбционной хроматографии это наиболее подходящий адсорбент. Применяют также объемно-пористые мелкозернистые адсорбенты на основе силикагеля, алюмогеля и других веществ.

   Определенные требования предъявляются к подвижной фазе — растворителю. Растворитель в жидкостной адсорбционной хроматографии должен хорошо растворять все компоненты анализируемой смеси, обладать химической инертностью по отношению к растворенным веществам, адсорбенту и кислороду воздуха, быть маловязким, не содержать примесей, не вызывать отклонений в работе детектора и быть доступным.

         Хотя изотермы адсорбции растворенных веществ, как и газов, описываются одним и тем же уравнением (1), все же процесс адсорбции из раствора осложняется участием растворителя. Подвижная фаза часто принимает участие в адсорбционном процессе и, таким образом, может влиять на селективность колонки. Эта особенность жидкостной адсорбционной хроматографии очень важна, так как открывает еще одну возможность регулирования хроматографического процесса и выбора оптимальных условий разделения.