Виды хромотографии

       Для элюирования смеси обычно применяют не индивидуальные растворители, а раствор одного или нескольких веществ в растворителе, который сам адсорбируется слабо, введенные же 
вещества адсорбируются сильнее нескольких, а возможно и всех компонентов анализируемой смеси. Состав    подвижной   фазы    можно изменять так, что ее вытесняющая способность будет непрерывно возрастать. Это градиентная хроматография.

     Элюирующую способность растворителей при адсорбции аа неорганических веществах часто оценивают по шкале Гильдебранда, основанной на энергии поляризации растворителей. Составленный по возрастанию энергии поляризации так называемый элюотропный ряд растворителей содержит растворители в порядке возрастания их элюирующей способности. Например, для оксида алюминия элюотропный ряд имеет вид: бензол < хлороформ < ацетон - диоксан < ацетонитрил < этанол < метанол.     Для неполярных адсорбентов (полиамиды, активированные угли и др.) порядок растворителей меняется. До подачи в систему растворитель подвергают дегазации, так как выделение пузырьков газа при повышении температуры в колонке или детекторе нежелательно. Дегазация проводится нагреванием или вакуумированием.

       Процесс жидкостной адсорбционной хроматографии идет под высоким давлением. Ввод пробы в колонку, в основном, производится с помощью шприца через самоуплотняющуюся резиновую прокладку и с помощью кранов. С помощью шприца объем пробы легко регулируется и проба может быть подана непосредственно на насадку, однако при высоких давлениях метод становится непригодным из-за неплотностей в поршне шприца. Система с кранами позволяет работать при высоких давлениях и может быть автоматизирована.

       Детекторы. Для определения концентрации вещества на выходе из хроматографической колонки можно или последовательно отбирать отдельные пробы и их затем анализировать, или проводить непрерывный анализ. Методика непосредственного анализа с автоматической записью концентраций имеет бесспорные достоинства. Создание чувствительных детекторов непрерывного действия в значительной степени обусловило современный уровень жидкостной адсорбционной хроматографии и ее успехи в разделении сложных многокомпонентных смесей. Практическое применение нашли детекторы, реагирующие на свойства раствора, растворенного вещества и на свойство вещества после удаления растворителя.

      Рефрактометрический детектор непрерывно измеряет разность показателей преломления между чистым растворителем и раствором после прохождения колонки. Чувствительность детектора достигает 3 мкг/мл. Он универсален, однако для получения надежных данных необходимо достаточно тонкое термостат) вание (±0,001 °С).

     Спектрометрические детекторы основаны на применении закона Бугера—Ламберта—Бера. Обычно используется светопоглощениие в ультрафиолетовом участке спектра, реже в инфракрасном. Детекторы этого типа являются высокочувствительными селективными приборами, позволяющими определять в потоке жидкой фазы весьма малые концентрации веществ. Их показания мало зависят от колебаний температуры и других случайных изменений среды. Одна из важных особенностей спектрометрических детекторов заключается в прозрачности большинства применяющихся в жидкостно-адсорбционной хроматографии растворителей в рабочей области длин волн.

    Чаще всего применяют поглощение в УФ, реже в ИК области. В УФ области применяют приборы, работающие в широком диапазоне – от 200 нм до видимой части спектра, либо на определенных длинах волн, чаще всего на 280 и 254 нм. В качестве источников излучения применяются ртутные лампы низкого давления (254 нм), среднего давления (280 нм) и соответствующие фильтры.

    Микроадсорбционные детекторы. В основе действия микроадсорбционных детекторов лежит выделение теплоты при адсорбции вещества на адсорбенте, которым заполнена ячейка детектора. Измеряется, однако, не теплота, а температура адсорбента, до которой он нагревается в результате адсорбции.

     Микроадсорбционный детектор – достаточно высокочувствительный инструмент. Его чувствительность зависит прежде всего от теплоты адсорбции.

    Микроадсорбционные детекторы являются универсальными, пригодными для детектирования как органических, так и неорганических веществ. Однако на них трудно получить достаточно четкие хроматограммы, особенно при неполном разделении компонентов смеси.

     В детекторах транспортного типа раствор после хроматограф и ческой колонки попадает на непрерывно движущуюся транспортную ленту, которая подается в печь, где происходит испарение элюента. Остаток на ленте переносится в реактор, где превращается в летучее соединение, которое далее анализируется методами газовой хроматографии

     Жидкостная хроматография представляет собой группу вариантов хроматографии, в которых подвижной фазой является жидкость.

Одним из вариантов жидкостной хроматографии  является жидкостно-адсорбционная  хроматография - это метод, в котором  неподвижной фазой является твердый  адсорбент.

В колоночной жидкостной хроматографии в качестве неподвижных фаз широкое распространение  получили оксид алюминия и силикагель. Реже применяют синтетический силикат  магния (флоризил), оксид магния, пористые стекла, пористые полимеры и неполярный адсорбент - активированный уголь. С появлением ВЭЖХ силикагель стал основной полярной неподвижной фазой. Таким образом, жидкостная адсорбционная хроматография (ЖАХ) на силикагеле - нормально-фазовая хроматография, в которой неподвижная фаза более полярна, чем подвижная. Для формирования ПФ в этом варианте хроматографии в качестве растворителей применяют неполярные алифатические углеводороды или дихлорметан, а в качестве модифицирующих добавок - спирты, простые ациклические и циклические эфиры, сложные эфиры, галогеналканы.     Главные преимущества силикагеля - относительная инертность, большая адсорбционная емкость, он легко поддается модификации: различные его типы значительно отличаются по размерам пор и суммарной удельной поверхности, измеренным в стандартных условиях. Поверхность силикагеля также можно модифицировать или покрыть пропитывающей средой.    В настоящее время известно более ста сортов (различных модификаций) силикагеля, а так же ряд силикагелей с химически модифицированной поверхностью, однако выбор элюента в ЖАХ играет более значимую роль, чем выбор неподвижной фазы. Меняя природу ПФ, можно в широких пределах изменять объемы удерживания и селективность разделения на одних и тех же адсорбентах.     Силикагель SiO2·хН20 имеет аморфную структуру, его внутренняя поверхность энергетически неоднородна из-за наличия нескольких типов беспорядочно распределенных силанольных ОН-групп. Кроме ОН-групп в адсорбционных процессах участвуют и поверхностные силоксановые группы ≡Si-O-Si≡. Присутствующая в силикагеле вода удерживается в нем в результате взаимодействия с поверхностными силанольными группами и за счет капиллярной конденсации.   а) свободная ОН-группа  б) связанная ОН-группа  в) геминальная ОН-группа  г) реакционноспособная ОН-группа.       ЖАХ основана на конкурентном взаимодействии полярных групп вещества и молекул растворителя с активными центрами адсорбента на его внутренней поверхности. Поверхность силикагеля, находящегося в равновесии с подвижной фазой всегда покрыта более или менее прочно связанным адсорбционным слоем. Если подвижная фаза содержит два или более компонентов, то состав адсорбционного слоя отличается от состава в объеме подвижной фазы. Адсорбция молекулы сорбата может происходить с вытеснением одной или нескольких молекул адсорбированного слоя или без него. Процессы взаимодействия молекул сорбата с адсорбционными слоями и поверхностью твердого адсорбента весьма сложны, главную роль в них играют ион-дипольные и диполь-дипольные взаимодействия. Селективность разделения в ЖАХ определяется не только межмолекулярным взаимодействием молекул данного сорбата, но и межмолекулярными взаимодействиями молекул ПФ как с адсорбентом, так и с молекулами сорбата, находящимися как на поверхности адсорбента, так и в адсорбционном слое и в объеме элюента.      В целом наблюдаются следующие закономерности.  Удерживание возрастает:  а) с увеличением полярности сорбата;  б) с уменьшением числа атомов углерода в его молекуле;  в) по мере уплощения молекулы и при увеличении числа π-электронов (для полиядерных соединений).  Удерживание уменьшается:  а) с увеличением степени экранирования полярных групп сорбата орто-заместителями;  б) при увеличении полярности подвижной фазы;  в) по мере дегидроксилирования поверхности адсорбента. Полярность  сорбата определяется числом и характером полярных функциональных групп. Ниже приведены  ряды функциональных групп органических веществ, расположенных в порядке  возрастания адсорбируемости на силикагеле: -СН2- < -СН3 < -СН=СН- < -S-R < -O-R < NO2 < -NH-(карбазол) < -C(0)OR < -С(0)Н < -C(0)R < -ОН < -NH2 < -С(0)ОН F- < Сl- < Br- < I- < -OR < -NR2 < -N02 < -C(0)OR < -C(0)R <-C(0)H < -NH2 < -NH-C(0)R < -OH < -C(0)OH < -SO3H Уже некоторые  несоответствия в двух приведенных  выше эмпирических рядах показывают, что они носят приблизительный  характер, поскольку существуют различия между алифатическими и ароматическими соединениями, имеет место влияние  дипольного момента и поляризуемости молекулы, стерический факторы, кислотность  адсорбента, полярность и селективность  подвижной фазы. ЖАХ на силикагеле обеспечивает наибольшую селективность  при разделении соединений, имеющих  различные функциональные группы и  различное число таких групп. В тоже время разделение веществ  гомологов и вообще веществ по молекулярной массе в силу специфического механизма удерживания в этом варианте хроматографии не эффективно. Разделение членов гомологического  ряда достигается только для первых членов и быстро падает с ростом числа метиленовых групп. Ограничением метода является растворимость сорбатов, они должны удовлетворительно растворяться в органических растворителях. Хроматографическая система в ЖАХ очень чувствительна  к влаге, медленно стабилизируется, поэтому градиентная хроматография  на силикагеле имеет плохую воспроизводимость  параметров удерживания и не целесообразна  для рутинных анализов. 1 - 2,4,6-триметилфенол  2 - 2,6-ксиленол  3 - 2,5-ксиленол  4 - 2,3-ксиленол  5 - 2,4-ксиленол  6 - о-крезол  7 - 3,5-ксиленол  8 - 3,4-ксиленол  9 - μ-крезол  10 - n-крезол  11 - фенол    Хроматограмма фенолов, полученная в условиях ЖАХ на колонке Zorbax Silica 250x4.6мм 6 мкм, демонстрирует высокую селективность в разделении сложной смеси фенолов: разделены изомеры, очень сложно разделяемые методом газовой хроматографии и обладающие очень близкими свойствами.       Оксид алюминия, как и силикагель, широко используют в колоночной хроматографии низкого давления и в ТСХ. Сорбенты на основе оксида алюминия показали повышенную селективность по сравнению с силикагелем в разделении многоядерных ароматических углеводородов, некоторых аминов.      Химическая неоднородность и каталитическая активность поверхности Аl2О3 выше, чем силикагеля. Оксид алюминия может вызывать разложение компонентов пробы или их необратимую сорбцию. Необратимо сорбирующиеся вещества, накапливаясь на начальном участке колонки, могут привести к повышению сопротивления колонки или даже к полной ее забивке. Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по мере повышения сопротивления заменяется на новую или перезаполняется новым сорбентом. Однако необратимая сорбция или реакции на сорбенте приводят к получению хроматограмм, на которых полностью или частично отсутствуют чувствительные к сорбции или каталитическому разложению компоненты пробы.

 

           Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис. 1).

Рис. 1. Адсорбционная  жидкостная хроматография.

 

1.2 Качественный и количественный анализ

     В жидкостной адсорбционной хроматографии, как и в газовой, идентификация веществ производится по характеристикам удержания, а количественный анализ основан на измерении высоты или площади хроматографического пика. Используется также анализ фракций раствора после хроматографической колонки различными химическими или физико-химическими методами.

   Жидкостная адсорбционная хроматография часто применяется в органической химии: в технологии и анализе. Этим методом весьма успешно изучают, например, состав нефти, керосина, углеводородов, эффективно разделяют транс- и цшг-из о меры, алкалоиды и т. д. Особенно большую роль она сыграла в разработке методов разделения, анализа и исследования нелетучих и нестабильных соединений. Очень эффективно применение жидкостной хроматографии при высоком давлении для разделения неполярных соединений и соединений со средней полярностью.

 

2.Тонкослойная хроматография

     Тонкослойная хроматография (ТСХ, TLC) - один из наиболее используемых методов хроматографического анализа, но наименее популяризируемый.

Несмотря  на существовавшие до недавнего времени  существенные недостатки, она широко используется для качественного  анализа смесей, в основном, за счет дешевизны и скорости получения результатов.

    Тонкослойная хроматография имеет множество возможностей и преимуществ, и может быть не только качественным методом анализа. И в то же время это – метод, требующий определенные навыки и знания, без которых он не может существовать.

 

2.1 Классификация хроматографических методов анализа

     Разнообразные варианты хроматографии укладываются в относительно простую схему классификации в зависимости от используемой подвижной фазы и характера межмолекулярных взаимодействий. Поскольку характер взаимодействий может быть очень различным – от чисто ситового эффекта к физической сорбции и далее к хемосорбции, то почти не существует объектов, для разделения которых не удавалось бы найти подходящего сорбента и систем растворителей. Области применения основных вариантов хроматографии в зависимости от молекулярной массы исследуемых соединений показаны на рис. 1.

     В области молекулярного анализа органических соединений хроматография преобладает над другими методами разделения, не заменяя их.

    Классификация вариантов хроматографии приведена в таблице 1 и на рис. 2. Следует иметь в виду, что в аналитической практике преобладает использование варианта проявительной хроматографии, когда подвижная фаза подается в хроматографическое устройство непрерывно, а разделяемая проба — периодически.

   При всем разнообразии вариантов хроматографии практически всегда реализуется общая схема процесса. Подвижная фаза (газ-носитель или жидкость) непрерывно пропускается через слой гранулированного сорбента, засыпанного в колонку.

В этот поток дозирующим устройством вводится импульсно анализируемая смесь, которая должна быть газообразной или  испаряться в дозаторе в случае газовой  хроматографии, или растворяться в  подвижной фазе в случае жидкостной. Перемещаясь потоком подвижной  фазы по колонке, анализируемая смесь  разделяется на составляющие ее компоненты: компоненты, сорбирующиеся хуже на данном сорбенте, двигаются быстрее  и вымываются из колонки раньше, чем сорбирующиеся лучше.

   Расположенный после колонки детектор фиксирует наличие в потоке компонентов; его сигнал, обычно пропорциональный концентрации или количеству компонента, записывается на самопишущем потенциометре (регистраторе) в виде хроматограммы — графика зависимости концентрации (количества от времени). Хроматограмма при полном разделении компонентов состоит из системы колоколобразных кривых, называемых пиками: каждый пик относится к одному или нескольким компонентам и соответствует возрастанию, а затем снижению концентрации в потоке подвижной фазы.

Рис. 1. Области применения основных вариантов хроматографии в зависимости  от молекулярной массы исследуемого вещества

Таблица 1. Варианты хроматографии по фазовым  состояниям

Подвижная фаза	Неподвижная фаза	Название  варианта
		частное	общее
Газ	Адсорбент	Газоадсорбционная	Газовая хроматография
	Жидкость	Газожидкостная
Жидкость	Адсорбент	Жидкостно-адсорбционная	Жидкостная  хроматография
	Жидкость	Жидкостно-адсорбционная
Газ или  пар в сверхкритическом состоянии	Адсорбент	Флюидно-адсорбционная	Флюидная  хроматография
	Жидкость	Флюидно-жидкостная
Коллоидная  система	Сложная композиция твердых и жидких компонентов		Полифазная  хроматография

 

2.2 Основы метода ТСХ

        Основой тонкослойной хроматографии является адсорбционный метод, хотя также встречается метод распределительной хроматографии. Адсорбционный метод основан на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-ваальсовских сил, являющейся основой физической адсорбции, полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата).

     Для эффективных процессов сорбции-десорбции необходима большая площадь, что предъявляет определенные требования к адсорбенту. При большой поверхности разделения фаз происходит быстрое установление равновесия между фазами компонентов смеси и эффективное разделение. Так физическое выражение адсорбции-десорбции в упрощенном виде можно выразить уравнением:

Г=(Г^~/К)с.

где Г^~ - предельно возможная величина адсорбции, К – константа равновесия;

с –концентрация  абсорбата.

     В более строгих подходах к теории адсорбции необходимо учитывать взаимодействие между адсорбированными частицами, неоднородность поверхности, давление, температуру и т.д. Но как видно из вышеописанного уравнения адсорбция является линейной функцией концентрации.

     Еще одним видом используемом в методе тонкослойной хроматографии является распределительная жидкостная хроматография.

    В распределительной хроматографии обе фазы - подвижная и неподвижная - жидкости, не смешивающиеся друг с другом. Разделение веществ основано на различии в их коэффициентах распределения между этими фазами.

   Впервые метод тонкослойной хроматографии заявил о себе как "Бумажная тонкослойная хроматография", которая основывалась на распределительном методе разделения компонентов.

2.3 Распределительная хроматография на бумаге

    В связи с тем, что используемая в этом методе хроматографическая бумага (специальные сорта фильтровальной бумаги) содержат в порах воду (20-22%), в качестве другой фазы используются органические растворители. Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов. Эти недостатки серьезно влияют на распространение хроматографии на бумаге как хроматографического метода.