Виды хромотографии

   Поэтому можно считать закономерным появление хроматографии в тонком слое сорбента – тонкослойной хроматографии.

         

2.4 Тонкослойная хроматография

    В этом методе хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в этом методе в основном происходит на основе сорбции-десорбции. Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и улучшить этот метод.

   В начале появления метода пластины приходилось изготавливать самостоятельно. Но на сегодняшний день в основном используются пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по размерам и носителям, так и по подложкам.

Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или  полимера (например политерефталат). В  связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто  бьется, нельзя разделить пластинку  на несколько частей не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры.

Для закрепления  сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна  сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более  мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине  в любом месте хроматографической пластинки.

    Сорбенты

    Наиболее распространенным сорбентом является силикагель.

     Силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм).

    Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров служит группы -ОН. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.

Окись алюминия. Окись алюминия является слабо основным адсорбентом и  используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин  на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед  использованием в сушильном шкафу  при высокой температуре (100-150 ⁰С) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя.

     Кизельгур - адсорбент, полученный из природных минералов: диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем. Кремнекислый магний менее полярный чем силикагель и обычно используется в случаях, когда более полярные адсорбенты не дали эффективного разделения.

   Целлюлоза - тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Но, как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно.

В ионообменных хроматографических пластинках в качестве адсорбента используют ионообменные смолы, содержащие четвертичный аммоний или  активные сульфогруппы, участвующие  в ионном обмене. Тонкослойная хроматография  с такого типа пластинками, проводится с подвижными фазами содержащими  сильные кислоты или щелочи. Данные пластинки эффективны для разделения высокомолекулярных и амфотерных соединений.

Вышеперечисленные сорбенты являются наиболее распространенными, но помимо этих существуют множество  веществ, используемых как сорбенты. Это тальк, сульфат кальция, крахмал  и т.д..

     В то же время даже уже указанные сорбенты могут быть модифицированы для придания им новых сорбционных свойств (пропитка сорбентов реактивами, например AgNO₃, создание пластин с обращенной фазой). Именно такое разнообразие возможных фаз при минимальных затратах позволяют использовать ТСХ для хроматографирования огромного числа веществ.

     Растворители

   В тонкослойной хроматографии, в качестве подвижной фазы используют либо чистые вещества (этилацетат, бензол и т.п.), либо смеси веществ (системы) в определенном соотношении.

  Подбор подвижной фазы (системы) проводится по следующим правилам:

Выбирают  такую систему, в которой разделяемые  компоненты имеют небольшую растворимость (если растворимость вещества высокая, то вещества будут перемещаться с  фронтом, при низкой растворимости - оставаться на старте). При распределительной  хроматографии или при использовании  обращенных фаз, растворимость веществ  должна быть выше в подвижной фазе, чем в неподвижной.

Состав  системы должен быть постоянным и  легко воспроизводимым.

Растворитель  или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.

Система должна полностью разделять вещества близкого строения, причем различия в R_f должно быть не менее 0,05.

Система не должна вызывать химические изменения  разделяемых компонентов.

В выбранной  системе анализируемые вещества должны иметь различные значения R_f и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения R_f лежало в пределах 0,05-0,85.

     При выборе системы также необходимо учитывать природу разделяемых веществ. Так, при хроматографировании веществ, имеющих основные свойства система не должна обладать кислотными свойствами и наоборот.

Эти рекомендации дают предварительную оценку выбранной  системы. Последнее слово все  равно остается за экспериментом.

   Тонкослойная хроматография имеет несколько способов, связанных, в основном, с видом движения растворителей.

1. Восходящая тонкослойная хроматография;

2.Нисходящая тонкослойная хроматография;

3.Горизонтальная тонкослойная хроматография;

4. Радиальная тонкослойная хроматография;

Восходящая  тонкослойная хроматография

    Этот вид хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт хроматографической системы поднимается по пластинке под действием капиллярных сил, т.е. фронт хроматографической системы движется снизу-вверх. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка.

     Метод восходящей тонкослойной хроматографии имеет ряд своих недостатков. Например, скорость поднятия фронта по пластинке происходит неравномерно, т.е. в нижней части она самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Это связано с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно уменьшается его концентрация и скорость движения замедляется. Для устранения этого недостатка по стенкам хроматографической камеры прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, по которым поднимающаяся хроматографическая система насыщает парами камеру по всему объему.

    Некоторые хроматографические камеры имеют на дне разделение на две ванночки. Это усовершенствование позволяет не только уменьшить расход хроматографической системы (для получения необходимой высоты хроматогратографической системы требуется меньший объем) но и использовать дополнительную кювету для растворителя, увеличивающего давления насыщенных паров в камере.

   Недостатком также можно считать необходимость следить за фронтом растворителя, так как возможно "убегание" лини фронта растворителя до верхнего края. В таком случае определить действительное значение R_f уже не представляется возможным.

Нисходящая  тонкослойная хроматография

    Этот метод хроматографии основан на том, что фронт хроматографической системы опускается по пластинке в основном под действием сил тяжести, т.е. фронт подвижной фазы движется сверху вниз Для этого метода в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает растворитель, который стекает и происходит хроматографирование исследуемого образца.

    К недостаткам этого метода можно отнести усложнение оборудования. Этот метод используется в основном в бумажной хроматографии.

Горизонтальная  тонкослойная хроматография

    Этот метод наиболее сложен в аппаратурном оформлении но наиболее удобен. Так, в хроматографической камере пластинка размещается горизонтально и подача системы происходит на один край пластинки с помощью фитиля. Фронт растворителя движется в противоположную сторону.

    Есть еще один прием, позволяющий предельно упростить камеру. Для этого хроматографическую пластинку на алюминиевой основе слегка изгибают и помещают в камеру. В данном случае система будет поступать с двух сторон одновременно. Для этой цели подходят только пластины с алюминиевой подложкой, так как пластиковая и стеклянная основа "несгибаема", т.е. не сохраняет форму.

    К достоинствам этого метода можно отнести то, что в горизонтальной кювете насыщение парами системы происходит гораздо быстрее, скорость движения фронта постоянная. А при хроматографировании с двух сторон, фронт не "убегает".

Радиальная  тонкослойная хроматография

    Радиальная тонкослойная хроматография заключается в том, что в центр пластинки наносится исследуемое вещество и туда же подается система, которая движется от центра к краю пластинки.

   Здесь приведены основные способы хроматографирования в тонкослойной хроматографии. Существует еще достаточно много способов хроматографирования

 

2.5 .Методы количественного анализа

    Количественный анализ в тонкослойной хроматографии имеет несколько видов, характеризующий каждый этап развития метода. И хотя некоторые методы можно применять только как полуколичественные, они до сих пор применяются на практике.

   Метод визуального сравнения. Как говорилось выше, интенсивность окраски пятна и его размер от количества хроматографируемого вещества. Поэтому визуальное количественное определение построено на нескольких приемах.

   Метод разбавления. Этот метод заключается в том, что для каждого вещества определяют предельную концентрацию, при которой вещество не может быть определено хроматографическим методом. При хроматографировании исследуемого вещества поводят разбавление до тех пор, пока оно перестает проявляться на пластинке. Содержание вещества С, определенное таким методом находят по формуле:

C = an

где n – разбавление, а – концентрация вещества, при котором оно не проявляется  при хроматографировании.

Метод определения площади пятна. Если наносить одинаковые объемы исследуемых  веществ и свидетелей, то получившиеся после хроматографирования площади  пятен пропорциональна логарифму  концентрации вещества.

S= alnc + b

где а  и b - эмпирические коэффициенты, определяемые экспериментальным путем.

Если  пятно разделенного вещества имеет  резкие границы, то площадь пятна  можно определить весовым методом (вырезать пятно и взвесить), замеряется планиметром. Этот метод дает ошибку до 10-15%.

   Однако он имеет ряд существенных недостатков. Первый и самый существенный в том, что таким образом можно определять концентрацию окрашенных веществ или имеющих флуоресценцию в УФ области (254, 366 нм). Этот недостаток можно устранить добавлением в сорбент различных люминофоров, то при этом увеличивается погрешность определения. Обработка пластин проявляющими веществами (реактивами) также может быть использована (например использование фильтровальной бумаги пропитанной проявляющим реагентом с последующим контактом с хроматографической пластинкой и дальнейшим определением на ней площади проявленного вещества), но погрешность определения также высока.