Использование ВЭЖХ в анализе антибиотиков

        Государственное  Бюджетное Общеобразовательное  Учреждение

                          Высшего Профессионального Образования

               Курский Государственный Медицинский  Университет

 

Кафедра фармацевтической, токсикологической и аналитической  химии

 

Зав. кафедрой

      Проф. Сипливая  Л.Е.

 

                     Курсовая работа по фармацевтической  химии

                                            

                                                 Тема работы:

                 

                 « Использование ВЭЖХ в анализе  антибиотиков»

 

Выполнила:

студентка 4 курса, 3 группы

фармацевтического факультета

Дорутова Анастасия Александровна

 

Руководитель:

Ст. преподаватель

Кукурека Александр Владимирович

                                                                                       

                                           Курск 2013

                                          Содержание

Введение…………………………………………………………………………..3

Глава 1.  Общая характеристика метода ВЭЖХ…………………………….4

1. Высокоэффективная жидкостная хроматография………………………..4
2. Состав жидкостного хроматографа……………………………………….4
3. Насосные системы и инжекторы………………………………………….5
4. Хроматографические колонки…………………………………………….6
5. Детекторы и устройства для сбора данных………………………………8

Глава 2.  Антибиотики и их классификация……………………………….12

1. Антибиотики………………………………………………………………12
2. Классификация антибиотиков…………………………………………...13

Глава 3. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе антибиотиков……………………………………………………….15

1. Применение ВЖЭХ в анализе антибиотиков группы цефалоспоринов и гликопептидов…………………………………………………………….15
2. Применение ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы  хинолонов и фторхинолонов……………………………………………………………17
3. Применение ВЭЖХ в анализе  противоопухолевых антибиотиков…..20
4. Применение ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы пенициллина......22
5. Использование ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы гликопептидов и рифамицинов………………....................................................................24
6. Анализ препарата Рулид и Азитромицина с помощью ВЭЖХ……....25
7. Определение концентрации антибактериальных глазных капель…….26

Заключение……………………………………………………………………...27

Список литературы…………………………………………………………….28

 

                                            Введение

В настоящее время ВЭЖХ занимает ведущие позиции среди других методов хроматографии.  Современная высокоэффективная жидкостная хроматография реализована в различных вариантах: обращеннофазовая, нормально фазовая, эксклюзионная, экстракционная, ионообменная и другие, что позволяют разделять  различные смеси лекарственных средств. ВЭЖХ является одним из наиболее важных методов исследования антибиотиков.  К тому же бурное развитие жидкостной хроматографии обусловлено, главным образом, интенсивной разработкой теоретических основ и практическим использованием ее высокоэффективного варианта, а также созданием и промышленным выпуском необходимых сорбентов и аппаратуры.

Сегодня ВЭЖХ представляет собой хорошо оформленный инструментальный метод, который широко применяют в самых  различных областях науки и техники.  Особенно    велико его значение в таких важнейших областях, как биохимия, молекулярная биология, контроль загрязнений    окружающей    среды, а также в химической, нефтехимической, пищевой и фармацевтической промышленности.

Цель: изучить применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе антибиотиков.

 

 

 

 

 

 

 

                     Глава 1. Общая характеристика метода ВЭЖХ

      1.1.  Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография  или жидкостная хроматография высокого давления является одним из вариантов колоночной жидкостной хроматографии[4]. Высокоэффективная жидкостная хроматография – метод разделения с использованием твердой неподвижной фазы и жидкой подвижной фазы. Разделение достигается за счет распределения, адсорбции или ионообменного процесса, в зависимости от используемого типа подвижной фазы. Высокоэффективная жидкостная хроматография имеет определенные преимущества перед газовой хроматографией. Анализируемые соединения растворяются в подходящем растворителе, и большинство разделений происходит при комнатной температуре. Таким образом, большинство нелетучих или термически нестабильных соединений, могут хроматографироваться без разложения или без необходимости получения летучих производных[26].

                   1.2.   Состав жидкостного хроматографа

Рис.1 Блок-схема жидкостного  хроматографа: 1 – резервуар для  подвижной фазы; 2 - насос; 3 - инжектор; 4 - колонка; 5 - термостат; 6 - детектор; 7 - регистрирующая система.

Жидкостный хроматограф  состоит  из резервуара, содержащего  подвижную фазу, насоса для пропускания подвижной фазы через систему под высоким давлением, инжектора для введения образца в подвижную фазу, хроматографические колонки, детектора и устройства для сбора данных (например, компьютера, интегратора или самописца). Кроме того дополнительно могут использовать компьютеры для контроля хроматографических настроек и операций, обеспечивая тем самым  длительные периоды автоматической работы[6].

                   1.3. Насосные системы и  инжекторы

 Насосные системы высокоэффективной жидкостной хроматографии используют для дозированной подачи подвижной фазы из резервуаров с растворителем в колонку через трубки и соединения с высоким давлением. Рабочее давления составляют обычно до 1500 psi (350 кг/выше, скорость до 10 мл/мин. Насосы, используемые для количественного анализа, должны быть изготовлены из материалов, устойчивых к компонентам подвижной фазы, и обладать способностью подачи подвижной фазы с постоянной скоростью и минимальным отклонениями в течение длительного периода времени.

После растворения в подвижной  фазе хроматографируемые соединения вводят в подвижную фазу, вручную шприцем  или петлевым дозатором, или автоматически  при помощи автодозатора.  Автодозатор  состоит из штатива для помещения  образцов, верхние части которых  имеют прокалываемую прокладку  или пробку и устройства ввода  для переноса образца из флаконов в петлю, откуда образец загружается  в хроматограф. Для некоторых  автодозаторов можно программировать контроль объема образца, число введений и циклов промывания петли, интервал между введениями и прочие рабочие параметры.

Шприц может использоваться для введения образцов вручную через  прокладку, если давление на входе колонки  менее 70 атм( около 1000 psi). При более высоких давлениях необходим пробоотборный клапан. Некоторые клапанные системы включают калиброванную петлю, заполняемую испытуемым раствором для переноса на колонку в подвижной фазе. В других системах, испытуемый раствор переносится шприцем в полость, а затем перенаправляется в подвижную фазу[26].

                        1.4.  Хроматографические колонки

Хроматографические колонки  представляют собой снабженные торцевыми соединениями трубки, заполненные тонкозернистыми упаковочным материалом (насадкой). Большинство колонок изготавливают из нержавеющей стали марки 316- стального сплава, который соответствует стандарту США. Этот сплав обладает отличительной устойчивостью к коррозии. Все металлические детали хроматографической системы, контактирующие с жидкостью, должны быть сделаны из этого сплава.  Качество обработки внутренних стенок должна отвечать определенным требованиям. Например, степень шероховатости стенок должна быть меньше одной десятой среднего размера частиц материала, заполняющего колонку        (шероховатость должна быть меньше 0,5 мкм, если колонка заполнена носителем с размером частиц 5мкм). Чтобы уменьшить шероховатость трубок, их футеруют стеклом или полимерами. В последнее время используют стеклянные трубки, которые имеют очень высокое качество поверхности трубок. Некоторые фирмы (Waters) используют для изготовления радиально сжимаемых колонок полиэтиленовые трубки. Эти колонки помещают в рубашку, в которой на них подается внешнее давление, что вызывает радиальное сжатие колонок, улучшающее их разрешающую способность и повышающее стабильность[2].  В зависимости от области применения используют колонки с различными диаметрами внутренних стенок, например для аналитического разделения используют  колонки с внутренним диаметром от 2 до 5 мм, а колонки большого диаметра используются для препаративной хроматографии.

В фармацевтическом анализе  разделение достигается распределением соединений испытуемого раствора между  подвижной и неподвижной фазами.В зависимости от полярности неподвижной и подвижной фаз различают нормальнофазовую и обращенно-фазовую хроматографию. В нормальнофазовой хроматографии используют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы, в обращенно-фазовой – неполярный адсорбент и полярные подвижные фазы[16]. Распределительная хроматография почти всегда используется для растворимых углеводородных соединений с молекулярной массой менее 1000. Сродство соединений к неподвижной фазе и его время удерживания на колонке контролируется изменением полярности фаз. Полярность подвижной фазы может изменяться добавлением второго, а иногда и третьего компонента.

Неподвижные фазы для современной   обращенно-фазовой жидкостный хроматографии обычно состоит из органической фазы, химически связанной с кремнеземом или иным материалом. Частицы обычно имеют диаметр от 3 до 10 мкм, но размер может изменяться до 50 мкм или более для препаративных колонок. Небольшие частицы, покрытые тонким слоем органической фазы, обеспечивают малое сопротивление массопереносу, а следовательно, быстрому переносу соединений между неподвижной и подвижной фазами. Полярность колонки зависит от полярности функциональных групп. Жидкие, не связанные неподвижные фазы не должны смешиваться с подвижной фазой. Тем не менее обычно необходимо предварительно насытить подвижную фазу неподвижной фазой для предотвращения выдавливания неподвижной фазы из колонки. Полимерные стационарные фазы, покрывающие носитель, более износостойкие.

Ионообменная хроматография  используется для разделения водорастворимых ионизируемых соединений с молекулярной массой менее 1500.  Неподвижные фазы - это обычно синтетические смолы. Катионобменные смолы содержат отрицательно заряженные активные участки и используются для разделения основных веществ, таких как амины, в то время как анионообменные смолы имеют положительно заряженные активные участки для разделения соединений с отрицательно заряженными группами, такими как фосфат, сульфонат или карбоксильная группа. Водорастворимые ионные или ионизируемые соединения притягиваются смолами, а разница в сродстве обуславливает хроматографическое разделение. Значение рH подвижной фазы, температура, тип иона, ионная концентрация и органические модификаторы влияют на равновесие. Для получения желаемой степени разделения данные параметры можно корректировать.

В эсклюзионной хроматографии  колонки набиваются пористой неподвижной фазой. Молекулы хроматографируемых соединений фильтруются в соответствии с размером. Молекулы, которые слишком большие для проникновения в поры, проходят через колонку без задержки. Меньшие молекулы попадают в поры и удерживаются тем дольше, чем меньше размер молекул. Эти колонки обычно используют для измерения агрегации и разложения больших молекул.

               1.5.   Детекторы и устройства для сбора данных

 Многие фармакопейные  методики высокоэффективной жидкостной  хроматографии требуют использования  спектрофотометрических детекторов. Такой детектор состоит из  проточной кюветы, закрепленной  на конце колонки. Пучок ультрафиолетового света проходит через кювету и попадает на детектор. По мере элюирования соединений из колонки они проходят через кювету и поглощают излучение, приводя к измеряемому изменению уровню энергии.

Широко доступны детекторы  с фиксированной, переменной и множественной длиной волны. Детекторы с фиксированной длиной волны работают при одиночной длине волны, обычно 254 нм, испускаемой ртутной лампой низкого давления. Детекторы с переменной длиной волны содержат непрерывный источник, такой как дейтериевая или ксеноновая лампа высокого давления, и монохроматор или интерференционный фильтр для получения монохроматического излучения с длиной волны, выбранной оператором. Точность длины волны детектора с переменной длиной волны, оснащенного монохроматором, необходимо проверять по рекомендованной производителем методике.  Если наблюдаемые длины волн отличаются более чем на 3 нм от истинных значений, необходима перекалибровка прибора. Современные детекторы с переменной длиной волны могут программироваться на изменение длины волны по ходу анализа.  Детекторы с множественными длинами волн измеряют  поглощение при двух или более длинах волн одновременно. В детекторах на диодной матрице непрерывное излучение пропускается через кювету с образцом, затем разрешается на составные длины волн, которые индивидуально детектируются фотодиодной матрицей. Эти детекторы получают данные на всем интервале УФ и видимого света, обеспечивая, таким образом, аналитика хроматограммами при множественных выбираемых длинах волн и спектрами элюируемых пиков. Детекторы на диодной  матрице  обычно имеют меньшее отношение сигнал/ шум, чем детекторы с фиксированной или переменной длиной волны, а следовательно, менее пригодны для анализа соединений, присутствующих в низких концентрациях.

Дифференциальные рефрактометрические  детекторы измеряют разность между показателем преломления чистой подвижной фазы и показателем преломления подвижной фазы, содержащей хроматографируемые соединения, по мере ее выхода из колонки. Рефрактометрические детекторы используют для детекции соединений, не поглощающих в УФ - области, но они мене чувствительны, чем УФ - детекторы. Они чувствительны к малым изменениям в составе растворителя, скорости потока и температуре, поэтому для получения удовлетворительной базовой линии может понадобиться колонка сравнения.