Использование ВЭЖХ в анализе антибиотиков

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Применение ВЭЖХ в анализе противоопухолевых антибиотиков

Доксорубицин - антибиотик широкого спектра действия. Он  является антибиотиком антрациклинового ряда и обладает противоопухолевым действием.

Согласно ВФС 42-1796-88, содержание доксорубицина определяют микробиологическим методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bac.cereus var. mycoides 537 (споры), который отличается большой трудоемкостью, длительностью и неспецифичностью. Из-за  недостатков микробилогического метода, доксорубицин определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Во время экспериментальной  части, принимали во внимание результаты исследования хроматографической активности доксорубицина в тонких слоях нормальнофазного (пластины "Silufol UV-254") и обращеннофазного (пластины "Silufol UV-254", обработанные вазелиновым маслом) сорбентов с применением подвижных фаз различной полярности, в качестве неподвижной фазы использовали обращеннофазный сорбент "Новопак Т-18", а в качестве элюента — систему растворителей изопропанол-ацетатный буфер (рН=4,5) в соотношении 3:7 (по объему). Определения проводили на хроматографе "Water Alian" (USA) с детектором фотодиодной матрицы на колонке размером 150x3,9 мм. Скорость подачи элюента составляла 0,7 мл/мин при температуре колонки 37°С.

На основании результатов  методик определения получили, что  разработанный вариант определений доксорубицина по методу ВЭЖХ, в отличие от фармакопейной (микробиологический метод диффузии в агар), характеризуется более высокой чувствительностью, селективностью и воспроизводимостью. Относительная ошибка среднего результата (n=5;P=0,95) при определении исследуемого вещества в субстанции и лекарственных формах по предлагаемой методике в 2-2,5 раза ниже, чем при использовании фармакопейной методики. Разработанная методика упрощает процесс анализа, сокращая в 35 раз его продолжительность (с 18 ч до 30 мин) и позволяет проводить определение Доксорубицина в присутствии других компонентов лекарственных форм[3]

Также высокоэффективную  жидкостную хроматографию использовали для  определения противоопухолевого препарата митомицина С (ММС) в образцах ткани мочевого пузыря методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим (365 нм) и масс-спектрометрическим детектированием с пределами обнаружения (отношение сигнал/шум = 3) 50 и 10 нг/мл соответственно. Образцы ткани гомогенизировали и проводили процедуру твердофазной экстракции на патроне DSC-18. Методика применена для сравнения эффективности проникновения ММС в ткань мочевого пузыря за счет пассивной диффузии и внутриполостного лекарственного электрофореза. Внутриполостной лекарственный электрофорез повышает степень проникновения митомицина в стенки мочевого пузыря в 3–5 раз по сравнению с пассивной диффузией[17].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Применение ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы пенициллина

Бициллин-3 является пенициллином пролонгированного действия и представляет собой смесь натриевой, новокаиновой и бензатиновой солей  бензилпенициллина. По действующей ВФС 42-3034—98 определение бензилпенициллина в препарате проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, новокаин определяют спектрофотометрически, а бензатин  экстрагируют эфиром из водного раствора, насыщенного хлоридом натрия. После выпаривания эфира бензатин определяют титрованием хлорной кислотой. В Европейской Фармакопее содержание бензилпенициллина и бензатина в бензатиновой соли бензилпенициллина определяют с помощью градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии в смеси метанола с раствором фосфата натрия при рН 3,5.

                                       Характеристика антибиотика

Использовали бициллин-3 производства АКО "Синтез" (Курган).

                                                     Аппаратура

Исследование  проводили на хроматографе фирмы "Waters" (США) с насосом модели 510, УФ-детектором модели 481 и инжектором модели 7125 (Rheodyne) с дозирующей петлей вместимостью 50 мкл. Для детектирования использовали длину волны 214 нм, при которой хорошо детектируются все анализируемые соединения. Регистрацию хроматограмм и расчет площадей пиков и основных параметров удерживания проводили с помощью персонального компьютера с аналого-цифровым преобразователем и программой "Мультихром".

Был изучен обращенно-фазный вариант метода ВЭЖХ на колонке "Luna С18(2)" размером 250 х 4,6 мм фирмы "Phenomenex" (США), поскольку колонка зарекомендовала себя ранее как относительно дешевая с улучшенной симметрией выхода пиков органических аминов. С этой же целью в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила с буферным раствором, содержащим в качестве одного из компонентов триэтиламин, имеющим рН= 5,0[18].

Также с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии был изложен  комплексный подход к конструированию высокоэффективной технологии получения полусинтетических антибиотиков, включающей не только стадию ферментативного синтеза, но и стадии разделения компонентов реакционной смеси.

                            Характеристика антибиотиков

В работе использовали  образцы  антибиотиков - ампициллина, амоксициллина, цефалексина, цефадроксила  и цефаклора, ацилирующие агенты - метиловый эфир Д- фенилглицина и метиловый эфир п – гидрокси – Д- фенилглицина.

В качестве биокатализатора использовали иммобилизованную аминоцефалоспоринсинтетазу их Xanthomonas rubrilineans, штамм ВКМ-629[24], полученную так, как это описано в работе[11,12].

                                     Аппаратура

Применяли хроматограф фирмы «  Waters Associates Inc.» (США) с УФ- детектором с переменной длинной волны и колонкой из нержавеющей стали, заполненной носителем « Sylasorb C18» с размером частиц 4,5 мкм. Скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин.

В качестве подвижной фазы использовали смеси метанола с фосфатно-аммиачным  буфером 0,05М, pH 2,05 в различных соотношениях[13].

 

 

 

5. Использование ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы гликопептидов и рифамицинов

С помощью высокоэффективной  жидкостной хроматографии  проводили  качественный и количественный анализ ряда антибиотиков-гликопептидов и грамицидина S на отечественном жидкостном микроколоночном хроматографе Милихром А-02. Кроме того  можно также проводить химическую идентификацию антибиотиков в неочищенных образцах, что важно для лабораторий, ведущих скрининг природных или полусинтетических антибиотиков[30].

При изучения условия десорбции антибиотиков  группы гликопептидов, такие как: эремомицин, ванкомицин, ристомицин А  и тейкопланин А2 определили, что они могут быть элюированы с ультрадисперсного углеродного сорбента при использовании органических растворителей (ТГФ, т-БС, ИП, ДМСО) в смеси с 0,5 М уксусной кислотой. Оптимальный растворитель и его концентрацию, обеспечивающую наиболее эффективную элюцию, подбирали индивидуально для каждого антибиотика. Показано, что для ристомицина А, ванкомицина и эремомицина наиболее эффективна элюирующая смесь, содержащая т-БС, а для тейкопланина А2 — TГФ. После десорбции физико-химические (молекулярная масса, УФ спектры, время удерживания при ВЭЖХ) и антимикробные свойства антибиотиков оставались неизменными[10].

При изучении антибиотиков группы рифамицины были получены  продукты деструкции и окисления рифампицина, которые охарактеризованы методом ВЭЖХ и идентифицированы методом масс-спектрометрии. Изучена стабильность рифампицина в водной фазе и в составе липосом при 4 и 25 °C. Показано, что при хранении основным продуктом деструкции в липосомах является 3-формилрифамицин SV. Установлено, что антибактериальная активность антибиотика в составе липосом не отличается от его активности в водной фазе и не изменяется при хранении[22].

6. Анализ препарата Рулид и Азитромицина с помощью ВЭЖХ

Для анализа двух препаратов были разработаны методики определения:

- разрабатывали методику определения антибиотика Рокситромицина в сыворотке крови методов ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием с использованием Кларитромицина  в качестве внутреннего стандарта. Методику использовали для исследования фармакокинетики лекарственного препарата “Рулид”. Рокситромицин и Кларитромицин из образцов сыворотки извлекали методом твердофазной экстракции на патроне с полярным сорбентом – цианопропилсилилсиликагелем. Абсолютная степень извлечения составила 89.6 и 92.5%, соответственно. Хроматографическое разделение проводили на колонке Nucleodur C₁₈ Isis с подвижной фазой вода–метанол– ацетонитрил–муравьиная кислота (499 : 250 : 250 : 1 по объему). Регистрировали в режиме мониторинга отдельных ионов с m/z 837.7 Рокситромицина и m/z 748.7 Кларитромицина соответственно[19].

- разрабатывали метод количественного определения азитромицина  ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Предел обнаружения препарата составляет 0,5 нг/мл. Метод был применен для изучения фармакокинетики и биоэквивалентности препарата Азитромицин (капсулы по 250 мг отечественного производства) в сравнении с препаратом Сумамед® (аналогичная лекарственная форма производства компании "Плива", Хорватия). Фармакокинетическое исследование проводилось открытым перекрестным рандомизированным методом. В исследование были включены 18 добровольцев. Были рассчитаны фармакокинетические параметры, необходимые для оценки биоэквивалентности изучаемого препарата. Статистический анализ параметров фармакокинетики показал биоэквивалентность препаратов Азитромицин и Сумамед[20].

 

 

7. Определение концентрации антибактериальных глазных капель.

 С помощью метода  ВЭЖХ-МС/МС определяли концентрацию антибактериальных глазных капель Сигницеф, Офтаквикс и Вигамокс в содержимом влаги передней камеры глаза (ВПКГ). В исследование включены 90 пациентов, которые были распределены на три группы по 30 человек. Пациентам первой группы закапывали 0,5% раствор моксифлоксацина (Вигамокс), пациентам второй и третьей группы 0,5% раствор левофлоксацина, соответственно, Офтаквикс и Сигницеф. Пациентам всех трех групп антибактериальные капли закапывали за один час до начала факоэмульсификации, четырехкратно по 1 капле с интервалом 15 минут. В результате, средняя концентрация глазных капель Офтаквикс и Вигамокс во ВПКГ была одинаковой и составляла, соответственно, 一 0,9 мкг/мл и 1,0 мкг/мл. В группе пациентов, которым в качестве профилактики послеоперационных осложнений назначали Сигницеф, средняя концентрация препарата равнялась -1,5 мкг/мл. Средняя концентрация всех исследуемых препаратов, которые принадлежат к фторхинолонам III-IV поколения, была в несколько раз выше, чем средняя МПК90 для выделенных от пациентов штаммов, что должно способствовать безопасному течению послеоперационного периода и профилактике инфекционных осложнений[21].

 

 

 

Заключение Метод ВЭЖХ имеет широкую  область применения. С помощью него проводят качественный и количественный анализ  антибиотиков различных групп, разрабатывают  новые методики  определения. Кроме того методом высокоэффективной жидкостной хроматографии был изложен  комплексный подход к конструированию высокоэффективной технологии получения полусинтетических антибиотиков, а также проводили анализы с полученными продуктами декструкции и окисления антибиотиков. Высокоэффективная жидкостная хроматография кроме медицины используется и в пищевой промышленности, там определяют остаточное количество антибиотиков, например тетрациклина и левомицетина в сыром и пастеризованном молоке.                                                                    Список литературы Антибактериальные лекарственные средства. Методы стандартизации препаратов.М.: ОАО « Издательство Медицина», 2004. 944с. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ. / Бауер Г., Энгельгард Х., Хеншен А. и др.; Под ред. А. Хеншен и др. М.: Мир, 1988.- 688с. Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе доксорубицина / В. К. Шарманов, Е.Н. Карпенко, Л.Е. Сипливая и др. // Журнал Фармация.2004.№3.С.810. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. – 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1987.336с. ГОСТ4214-78. Реактивы. Кислота кремневая водная. Технические условия. Грушка, Э. Количественный анализ хроматографическими методами. / Грушка Э., Йенсен Э., Хатиб С., Левин С. и др.; Под ред. Кэц: Пер. с англ. М.: Мир, 1990.320с. Егоров, Н.С. Основные учения об антибиотиках: Учеб. для студентов биолог. спец. ун-тов. 4-е изд., перераб. и доп.М.: Высш. шк., 1986448с. Земнухова, Л.А., Федорищева, Г.А., Егоров, А.Г., Сергиенко, В.И. //  Журнал прикладной химии. 2005. Т. 78, № 2.С. 324 – 328. Земнухова, Л.А., Егоров, А.Г., Федорищева, Г.А., Баринов, Н.Н., Сокольницкая, Т.А., Боцул, А.И. // Неорганические материалы. 2006. Т. 42, №1. С. 27 – 32. Изучение сорбции антибиотиков – гликопептидов на ультрадисперсном углеродном сорбенте /А. В. Тимофеева, В.Н. Буравцев  и др. // Журнал Биотехнология.2010.№ 2.С. 7080. Курочкина В. Б., Ныс П. С.,  Антибиотики и химиотерапия, 44(5), 12 – 16 (1999). Курочкина В. Б. , Ныс П. С. , Антибиотики и химиотерапия, 44(8), 6 –11 (1999). Курочкина, В. Б. Ферментативный синтез аминобеталактамов. Физико- химические основы процессов разделения компонентов реакционных смесей /  В. Б. Курочкина, П. С. Ныс // Химико- фармацевтический журнал.2003.Т. 35, № 12.С.3037. Коновалов, А.А. ,Дорофеев, В.Л., Арзамасцев, А. П. / Фармацевтический анализ лекарственных средств группы фторхинолонов с использованием метода ВЭЖХ // Вестник. Серия: Химия. Биология. Фармация.2004.№2.С.216-221. Машкова, С.А., Разов, В.И., Тонких, И.В., Жамская, Н.Н. и др. // Химия и химическая технология. 2005. Т. 48, Вып. 6. С. 149-152. Основы аналитической химии. В 2 т. Т. 1: учеб. Для студ. Учреждений высш. Проф. Образования / Т.А. Большова, Г.Д. Брыкина, С.Г. Дмитриенко и др.; Под ред. Ю. А. Золотова. 5-е изд., стер.- М.: Издательский центр « Академия», 2012.384с. Определение митомицина С в тканях мочевого пузыря методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии /   А. А. Сидорова, Л. А. Карцова, А. В. Григорьев, В. В. Протощак, Е. А. Мурашко // Журнал аналитической химии. 2010.Т. 65, № 8. С. 856860. Определение  компонентов препарата « Бициллин 3» методом высокоэффективной жидкостной хроматографией / М. А. Казьмин, А. В. Михалев, А. П. Арзамасцев // Журнал Фармация. 2002.№3.С.911. Определение рокситромицина в сыворотке крови методом жидкостной хроматографии с масс спектрометрическим детектированием / И. В. Семак, А. Н. Алексеев и др. // Журнал аналитической химии.2011.Т. 66, № 2.С. 199205. Определение азитромицина в плазме крови методом ВЭЖХ с масс спектрометрическим детектированием / В. В. Писарев, Л. Б. Смирнова, Н. Е. Москалева и др. // Журнал Клин.фармакокинетика.2004.№1.С. 2326. Определение концентрации глазных капель левофлоксацина и моксифлоксацина  в содержимом влаги передней камеры глаза  методом ВЭЖХ МС / И. Н. Околов, Ю. В. Тахтаев, А. И. Мяжитова и др. // Журнал Катарактальная и рефракционная хирургия.2012.Т. 12, № 4.С. 4451. Продукты деструкции и бактериостатическая активность рифампицина в водном растворе и в составе липосом / Г. М. Сорокоумова, В. В. Востриков, А. А. Селищева и др. // Химико-фармацевтический журнал.2008.Т. 42, № 8.С. 35 38. Смирнова,Т.Д. Обращено-фазовая ВЭЖХ флюмеквина и ципрофлоксацина в организованных средах / Т. Д. Смирнова,С. Н. Штыков, Н. В. Неврюева // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т. 10, Вып. 1.С. 142 149. Уваров, Н. Н.,Крестьянова, И. Н., Дмитриева С. Д. , Антибиотики и химиотерапия, 37(4), 16-19 (1992). Фармакология / Под ред. Проф. Р.Н. Аляутдина.4-е изд.; перераб. и доп.М.: ГЭОТАР - Медиа, 2008. 832с. Фармакопея США: USP 29; Национальный формуляр : NF 24 : в 2 т. :     [ пер. с англ.].М.: ГЭОТАРМедиа, 2009.Т.2 С. 25042511. Чучалина, И.В. Концентрирование цефалоспориновых антибиотиков на природных сорбентах // электронный научный журнал «Исследовано в России».2006 С.1842-1851[Электронный ресурс]. URL: http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/196.pdf . Шапкин, Н. П, Поляков, В.Ю., Шапкина, В.Я, Сибирцев, Ю.Т. и др. // Химия и химическая технология. 2002. Т. 45, вып. 2. С. 101-106. Штыков  С.Н.  Химический  анализ  в  нанореакторах.  Основные  понятия  и применение // Журн. аналит. химии. 2002. Т.57, №10. С.1018-1028. Экспрессанализ антибиотиков пептидной группы на микроколоночном хроматографе Милихром А 02 / А. В. Тимофеева, М. В. Серебрякова, Л. А. Баратова,  Г. С. Катруха //  Журнал Биотехнология.2009.№ 1.С.90 95. Shervington L. A., Abba M., Hussain B. and Donnelly J. The simultaneous separation  and determination of five quinolone antibotics using isocratic reversed-phase HPLC:  Application to stability studies on an ofloxacin tablet formulation // J. Pharm. Biomed.  Anal. 2005. V. 39. №3-4. P.769-775. Inês M., Santoro R.M., Kassab N. M., Singh A.l K., Kedor-Hackmam E. M. Quantitative determination of gatifloxacin, levofloxacin, lomefloxacin and pefloxacin  fluoroquinolonic antibiotics in pharmaceutical preparations by high-performance liquid  chromatography // J. Pharm. Biomed. Anal. 2006. V. 40. №1. P.179-184. Mancean S., Giequel M., Lanrentie M. Simultaneous determination of enrofloxacin and  ciprofloxacin in animal biomedical fluidsby high-performance liquid chromatography.  Application in pharmacokinetic studies in pig and rabbit // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci.  Appl. 1999. V.726. №1-2. P.175-178. Imre S., Dogaru M.T., Vari C.E., MunteanT., Kelemen L. Validation of an HPLC  method for the determination of ciprofloxacin inhuman plasma // J. Pharm. Biomed. Anal.  2003. V. 33. №1. P.125-130. Ramos M., Aranda A., Garcia E., Reuvers T., Hooghuis H. Simple and senstive determination of five quinolones in food by liquid chromatography with fluorescence detection // J. Chromatogr. B. 2003. V. 789. №2. P.373-381. Zotou A., Miltiadou N. Sensitive LCdetermination of ciprofloxacin in  pharmaceutical preparations and biological fluidswith fluorescence detection // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002.V. 28. №3-4. P.559-568. El-Kemary M., Dauhal A. Photochemistry and photophysics of cyclodeхtrin caged  drugs: relevance to their stability and efficiency // Cyclodeхtrin materials in  photochemictry, photoph. Ed. by Douhal A. - Elsevier. 2006. V.1.  P.79-105.