Использование ВЭЖХ в анализе антибиотиков

Флуориметрические детекторы  чувствительны к соединениям, которые  по своей природе флуоресцируют  или могут быть превращены во флуоресцирующие производные либо химической трансформацией вещества, либо соединением с флуоресцентными реактивами по специфическим функциональным группам. Если необходима дериватизация, то ее можно провести непосредственно перед хроматографическим разделением или реактив можно ввести в подвижную фазу непосредственно перед его попаданием в детектор.

Потенциометрический вольтаметрический  или полярографический электрохимические  электроды используют для количественного  определения веществ, которые могут  окисляться или восстанавливаться  на рабочем электроде. Эти детекторы селективны, чувствительны и надежны, но необходимо применение подвижной фазы, не содержащей растворенного кислорода и восстанавливаемых ионов металлов. Должен использоваться непульсирующий насос и необходимо следить за обеспечением постоянства значения рH, ионной силы и температуры подвижной фазы. Рабочие электроды чувствительны к загрязнению продуктами реакции с соответственно изменяющимся откликом.

Электрохимические детекторы  с угольными пастовыми электродами  могут успешно применяться для  измерения нанограммовых количеств  легко окисляемых соединений, в особенности  фенолов и кетонов.

Продолжают разрабатываться  новые детекторы для преодоления  недостатков используемых детекторов.

Современные станции обработки  данных получают и сохраняют сигнал детектора и распечатывают хроматограммы  вместе с площадями, высотами пиков, идентификацией образцов и параметрами  хроматографирования. Станции обработки  данных используют также для программирования жидкостного хроматографа, контролируя большинство рабочих параметров и обеспечивая длительные периоды автоматической работы.

Данные также могут  собираться на простых самописцах для  ручного измерения или на независимых  интеграторах, возможности которых  колеблются от обеспечения распечатки площадей пиков до предоставления хроматограмм с рассчитанными площадями и высотами пиков и сохраненными данными для возможного перерасчета[26].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                Глава 2 .  Антибиотики и их классификация

                                 2.1.  Антибиотики и их классификация

Антибиотики – это специфические продукты жизнедеятельности или их модификации, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (вирусов, бактериям, актиномицетам, грибам, водорослям, протозоа) или к злокачественным опухолям, избирательно задерживая их рост или полностью подавляя развитие.

Антибиотические вещества в  процессе развития их продуцентов могут  выделяться и накапливаться в  окружающей организм среде, они могут  образовываться в виде летучих продуктов или накапливаться внутри клеток организма и освобождаться от них в результате экстракции или при разрушении клеток. В соответствии  с определением понятия « антибиотик » к этим веществам относятся также химические или биологические модификации молекул природных соединений антибиотиков путем замены в них тех или иных свободных группировок. В результате химической модификации молекул пенициллина, цефалоспорина, тетрациклина и некоторых других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, образующихся в процессе биосинтеза, получены новые соединения с более ценными свойствами.

Выражение величин биологической  активности антибиотиков производят в условных единицах, содержащихся в 1 мл раствора (ед/мл) или в 1 г препарата (ед/мг)[7].

 

 

 

 

 

                                 2.2. Классификация антибиотиков

1. Пенициллины (-лактамные антибиотики)

а) природные пенициллины: бензилпенициллин и его соли, феноксиметил-пенициллин;

б) полусинтетические пенициллины:

— пенициллиназоустойчивые  с преимущественной активностью  в отношении стафилококков: оксациллин, клоксациллин, флуклоксациллин;

— широкого спектра действия (аминопенициллины): ампициллин, амокси-циллин, пивампициллин;

— широкого спектра действия, особенно высокоактивные в отношении  си-негнойной палочки и других грамотрицателъных бактерий (карбокси - и уреи-допенициллины): карбенициллин, тикаришин, азлоциллин, мезлоциллин, пиперациллин;

2. Цефалоспорины (-лактамные антибиотики)

а) первое поколение: цефалоридин, цефазолин, цефалексин и др.;

б) второе поколение: цефамандол, цефуроксим, цефаклор и др.;

в) третье поколение: цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон и др.;

г) четвертое поколение: цефпиром, цефепим и другие[25];

3. Монобактамы (-лактамные антибиотики): азтреонам;
4. Карбапенемы (-лактамные антибиотики): имипенем, меронем, тиенам;
5. Макролиды:

а) природные — джозамицин, мидекамицин, олеандомицин, эритромицин;  
б)полусинтетические — азитромицин, диритромицин, кларитромицин, рокситромицин, спирамицин;

6. Аминогликозиды:

а) первое поколение: стрептомицин, мономицин, канамицин;

б) второе поколение: гентамицин, нетилмицин, тобрамицин;

в) третье поколение: тобрамицин, сизомицин, амикацин;

г) четвертое поколение: левомицетин;

7. Тетрациклины:

а) естественные: тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин;

б) полусинтетические: метациклин, доксициклин, миноциклин, морфоцик-лин;

8. Рифамицины: рифоцин, рифамид, рифампицин;
9. Гликопептидные антибиотики: ванкомицин, тейкопланин;
10. Хинолоны: налидиксовая кислота, оксолиновая кислота;
11. Фторхинолоны :

а) препараты первого - пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин, ломефлоксацин, норфлоксацин;

б) второго поколения - ,левофлоксацин, спарфлоксацин;

в) третьего и четвертого поколения - омоксифлоксацин, гемифлоксацин, гатифлоксацин, ситафлоксацин, тровафлоксацин;

12. Полимиксины: полимиксин В, полимиксин Е, полимиксин М;
13. Полиеновые антибиотики: нистатин, леворин, амфотерицин В;
14. Прочие: гризеофульвин, деквалиниума хлорид, тербинафин,доксорубицин, адриамицин, даунорубицин, эпирубицин и другие[1,7].

 

 

Глава 3.  Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе антибиотиков

Высокоэффективная жидкостная хроматография  является одним из самых  эффективных, селективных и чувствительных методов. Из-за своих достоинств, он  широко применяется  в различных анализах многих лекарственных средств. Рассмотрим некоторые из них:

3.1.  Применение ВЖЭХ в анализе антибиотиков группы цефалоспоринов и гликопептидов

С помощью   обращено - фазовой высокоэффективной  жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) определяли  антибиотики группы цефалоспоринов 1 - 3 поколений  после изучения их сорбционной способности. Изучение сорбционной способности проводили в статических  условиях  на  кремнийсодержащих  сорбентах  разного происхождения[27].

            Характеристика исследованных антибиотиков

Фармацевтические формы: цефазолин (натриевая соль)®, цефуроксим и  цефтриаксон® – были  получены  из  аптечной  сети.  Им  соответствуют стандартные  образцы  цефазолина,  цефуроксима  и  цефтриакосна.  Одна упаковка каждого из используемых лекарственных препаратов содержит 1г химически чистого антибиотика. Растворы антибиотиков готовили исходя из терапевтических доз с концентрацией 0,25-2 мг/мл.

            В качестве сорбентов использовали следующие образцы:

1. природный  слоистый  алюмосиликат[15];

2. природный   клиноптилолит[28];

3. сорбенты  на основе рисовой шелухи (РШ), которые представляют

собой  аморфные  образцы  кремнезема  с  разным  содержанием  основного

вещества, SiO2(>99,9; 96 и92%), а также – карбонизированный  кремнезем,

содержащий46% SiO2 и50% С[8,9];

4. реактив  - кислота кремниевая водная, SiO2·nH2O, соответствующая ГОСТ4214-78[5].

                                       Аппаратура

Жидкостной  хроматограф «Shimadzu» LC-6A (Япония),  с  УФ-детектором; рабочие  длины волн 220 и254 нм. Колонка Zorbax ODS (4,5 х15мм),  подвижная  фаза  ацетонитрил:  вода (50:50 v/v).  Хроматомасс-спектрометр Agilent 1100 SerieesLC/MSD (APCI). Колонка Hyperssil ODS  (4,5 х125 мм), детектор - диодная матрица, рабочие длины волн210 и254 нм,  подвижная  фаза ацетонитрил: вода(50:50 v/v).

После исследований  обнаружено,  что для концентрирования  цефуроксима  и  цефтриаксона  при  их  концентрации  в растворе 0,5 – 1,5 мг/мл можно рекомендовать сорбенты, полученные на основе рисовой шелухи: аморфный кремнезем с содержаниемSiO2 не ниже 99,9%  и  карбонизированный  кремнезем(SiO246,5%).  Для концентрирования  цефазолина  следует  использовать  кремневую  кислоту,  соответствующую  по  характеристике[5],  либо  карбонизированный кремнезем.

 

 

 

 

 

 

2. Применение ВЭЖХ в анализе антибиотиков группы  хинолонов и фторхинолонов

Для  определения  фторхинолонов  наиболее  часто  используют метод  обращено - фазовой высокоэффективной  жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с  УФ-детектором при λ=235 нм[31]  и λ=279-295 нм[32], который предложен для определения четырех и более фторхинолонов в диапазоне 4.0 – 24.0 мг/кг на колонках PhenomeneхODS C18[31,33] и LiChrosper RP-18[32].  Понизить  предел  обнаружения и расширить диапазон  определяемых концентраций можно при использовании флуориметрического детектора, поскольку многие фторхинолоны обладают флуоресцентными свойствами.

Флуориметрическое детектирование с  пределом обнаружения 5 мкг/мл применяли при определении ципрофлоксацина в плазме крови[34], свиных и лососевых мышцах[35] при λ возб=278-280 нм.  В качестве  подвижной фазы   используют  смесь ацетонитрил – фосфатный буфер(рН=3.0)[34,36], ацетонитрил – метанол- ацетатный буфер (рН =3.6) [37]. Необходимо  отметить,  что во  многих  методиках в целях улучшения аналитических характеристик используют токсичные растворители, такие как ацетонитрил и метанол[37].  

                                                         Реагенты 

Растворы всех основных и вспомогательных  химических реактивов готовили  на  бидистиллированной  воде. 

Антибиотики  фторхинолонового  ряда - ципрофлоксацин, налидиксовая кислота, флюмеквин («Sigma»), а также  тетрациклин и окситетрациклин («Merсk»), содержали не менее 98% основного вещества. Рабочие растворы концентрации 0.25 мг/мл готовили растворением  точной  навески  антибиотиков.  Использовали  водные  растворы катионных (бромид  цетилтриметиламмония  и  хлорид  цетилпиридиния,  фирмы «Мerсk»), анионных (додецилсульфат натрия, «AppliChem») и неионогенных ПАВ (Тритон Х-100, Тритон Х-305, Бридж35, Твин80 фирмы «Sigma»). Содержание основного  вещества  во  всех  препаратах  ПАВ    не  менее99%.  α- , β-, γ–  циклодекстрины  фирмы «Fluka», содержание  основного  вещества  не  менее 98%.  Для  приготовления  подвижной  фазы  использовали  ацетонитрил хроматографической  чистоты,  фирмы «Panteac», 99,9 %  основного  вещества.  Ацетатно-аммиачные  буферные  растворы  готовили  из 2М    и .

                                                  Аппаратура

 Хроматограммы регистрировали  на жидкостном хроматографе «Стайер»  фирмы «Аквилон»  с  флуориметрическим  детектором.  Антибиотики разделяли на ОФ колонке Phenomenex Luna 5u C18(150×4.60 мм, 5мкм), снабженной предколонкой с защитным картриджем Phenomenex C18, 5мкм при температуре в изократическом  режиме.  Для записи  и обработки хроматограмм  использовали программу «Мультихром-2.4». Детектирующее устройство: источник возбуждения–  кварцевая галогеновая лампа с дихроическим  рефлектором,  фотоэлектронный умножитель, диапазон длин волн 200-600 нм.

При изучение  влияния  природы  и концентрации  ПАВ,  а  также  циклодекстринов  на  разделение  и чувствительность определения флюмеквина и ципрофлоксацина в смеси с другими антибиотиками выяснили, что среди  исследованных  ПАВ  различных  классов  наилучшее разделение и определение флюмеквина и ципрофлоксацина достигается в подвижной фазе,  содержащей  неионогенный  ПАВ Тритон  Х-100,  который  способствует увеличению  площади  хроматографического  пика  фторхинолонов  в  1,9  раз, а образование  комплексов  включения  фторхинолонов с γ-циклодекстрином увеличивает площадь хроматографического пика флюмеквина  и ципрофлоксацина в 2,3 и1,5 раза и пределы обнаружения уменьшает в 4,2 и 9 раз, соответственно[23].

Показано, что при анализе  спарфлоксацина и моксифлоксацина  методом ВЭЖХ, добавление в подвижную фазу  ионпарного реагента существенно повышает эффективность колонки и симметричность пиков анализируемых соединений. Установлено, что в условиях обращеннофазовой ВЭЖХ оптимальные значения хроматографических параметров наблюдаются в подвижной фазе ацетонитрил вода при температуре колонки 40 Разработанные методики могут быть использованы при анализе субстанций и лекарственных препаратов спарфлоксацина и моксифлоксацина по разделам нормативной документации « подлинность» и « количественное определение»[14].