Клиническая токсикология. Содержание предмета, задачи, понятие о ядах и отравлениях

Расчет количественного содержания этилового спирта в крови или в моче производится по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Сначала приготовляют серию стандартных растворов, содержащих 2, 3, 4 и 5 % 0 этилового спирта, и раствор внутреннего стандарта, содержащий 4 % 0 пропилового спирта. В несколько флаконов из-под пенициллина вносят по 2 мл раствора, содержащего по 4 % 0 пропилового спирта. В каждый флакон прибавляют по 2 мл раствора этилового спирта различной концентрации (2, 3, 4 и 5% 0 ). Содержимое флаконов хорошо перемешивают, а затем берут по 1 мл смеси спиртов из каждого флакона и переносят в другие флаконы из-под пенициллина. В каждый флакон прибавляют по 0,5 мл 50 %-го раствора трихлоруксусной кислоты. Флаконы закрывают резиновыми пробками, которые закрепляют фиксаторами. Затем с помощью шприца через резиновую пробку во флаконы вносят по 0,25 мл 30 %-го раствора нитрита натрия. Содержимое флаконов взбалтывают в течение одной минуты. После этого с помощью другого сухого шприца из флаконов отбирают по 3 мл газообразной фазы, которую вводят в дозатор хроматографа, и хроматографируют.

Условия хроматографирования указаны выше при описании способа обнаружения этилового спирта в напитках и растворах.

На хроматограммах измеряют площадь или высоту каждого пика. Затем находят отношение площади или высоты пика этилового спирта (этилнитрита) к площади или высоте пика внутреннего стандарта (пропилнитрита). Учитывая, что при этом для разных концентраций этилового спирта получаются величины, незначительно отличающиеся друг от друга, их умножают на 100 и результаты умножения наносят на ось ординат калибровочного графика. На ось абсцисс калибровочного графика наносят значение концентраций этилового спирта (в % 0 ).

Определение этилового спирта в крови и моче. Во флакон из-под пенициллина вносят 2 мл раствора внутреннего стандарта (пропилового спирта, концентрация которого составляет 4% 0 ), прибавляют 2 мл крови или мочи, подлежащей исследованию на наличие этилового спирта. Содержимое флакона хорошо взбалтывают, а затем 1 мл жидкости (смеси крови или мочи с внутренним стандартом) переносят в другой флакон из-под пенициллина и прибавляют 0,5 мл 50 %-го раствора трихлоруксусной кислоты. Флакон закрывают резиновой пробкой, которую закрепляют фиксатором. При помощи шприца через пробку во флакон вносят 0,25 мл 30%-го раствора нитрита натрия. Содержимое флакона взбалтывают в течение одной минуты. Затем при помощи другого сухого шприца отбирают из флакона 3 мл газообразной фазы, которую переносят в дозатор хроматографа, и проводят хроматографирование.

На хроматограмме определяют площади или высоты пиков и рассчитывают отношение площади или высоты пика этилового спирта к площади или высоте пика внутреннего стандарта. На основании этого отношения, умноженного на 100, по калибровочному графику рассчитывают содержание этилового спирта в крови или в моче (в % 0 ).

При определении этилового спирта в крови найденную по калибровочному графику концентрацию этого спирта умножают на 0,95, а найденную концентрацию этилового спирта в моче умножают на 1,05.

5. Какова последовательность проведения изолирования по методу Крамаренко В.Ф. Достоинства и недостатки

В зависимости от поставленной перед экспертом-химиком задачи, судебно-химическое исследование может носить общий или частный характер, т.е. анализ может быть ненаправленным (общим) или направленным (частным).

Частное исследование предусматривает проведение анализа на какое-то определенное вещество или группу веществ. Например, на производные барбитуровой кислоты, на алкалоиды или даже на одно конкретное вещество. При частном исследовании метод изолирования подбирается с учётом физико-химических свойств того соединения (или группы соединений), на которое производится анализ.

Общий анализ включает исследование на несколько групп веществ (3 группы), подлежащих обязательному судебно-химическому исследованию, в том числе и на группу «нелетучих» ядов. В этом случае используются общие для всей группы веществ (универсальные) методы изолирования.

Общими методами изолирования «нелетучих» ядов являются:

1. Изолирование подкисленным  этанолом.

2. Изолирование водой, подкисленной  щавелевой кислотой.

Оба метода вначале были разработаны для алкалоидов, а затем применены и к другим веществам.

1. Изолирование нейтральным  ацетоном.

Изолирование подкисленным этанолом

Самый первый метод изолирования подкисленным спиртом, названный по имени авторов методом Стаса - Отто, применялся только для алкалоидов. В дальнейшем это метод претерпел серьёзные изменения и стал использоваться не только для алкалоидов, но и для многих других ядовитых и сильнодействующих веществ, имеющих токсикологическое значение.

Современная модификация метода состоит из этапов:

* Настаивание измельчённого  объекта с этиловым спиртом, подкисленным  щавелевой кислотой до рН 2 - 3, в течение суток. Спирт берётся в количестве, необходимом для покрытия объекта до «зеркала». Спиртовое извлечение сливается и вся операция повторяется трехкратно.

* Упаривание объединённых  спиртовых извлечений при температуре 40 - 50 °С до густого остатка, в  который по каплям добавляют абсолютный этанол для коагуляции белков. Осадок отфильтровывают и всю операцию осаждения повторяют по мере необходимости до полного удаления белковых соединений.

* Упаривание фильтрата  при той же температуре до  густого остатка и разбавление горячей водой для удаления смолистых веществ, жиров и пигментов. Осадок отфильтровывают.

* Экстрагирование веществ  кислого, нейтрального и слабоосновного  характера in водного фильтрата хлороформом  при рН = 2 (трёхкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием (фракция А, «кислое» извлечение).

* Подщелачивание оставшегося  после разделения фаз водного  слоя до рН 9 10, экстрагирование  веществ сильноосновного характера (трёхкратная экстракция) хлороформом, отделение органической фазы и концентрирование упариванием (фракции Б, «щелочное» извлечение).

Достоинства метода заключаются в следующем:

1.Метод универсален, т.к. этанол является хорошим растворителем  для многих веществ этой группы (как ионизированных, так и молекулярных форм).

2.Метод предусматривает  очистку извлечения от балластных  веществ, в результате чего получаются  чистые хлороформные извлечения, не дающие эмульсий при экстрагировании  веществ из водной фазы хлороформом. Метод даёт возможность изолировать до 30 % барбитуратов и 20 - 25 % алкалоидов.

К недостаткам метода следует отнести:

1.Длительность (8-10 рабочих  дней) и многостадийность. Большое количестве операций, связанных с осаждением белков и фильтрованием, ведёт к значительным потерям искомых веществ (алкалоиды теряются на 25 - 50 %).

2. Сравнительная дороговизна  метода (на 1 исследование тратится  до 500 мл этанола). Все это приводит  к тому, что классический метод Стаса - Отто теряет своё былое

значение и постепенно заменяется более быстрыми, эффективными и экономным» методами извлечения подкисленной водой.

В настоящее время метод применяется, главным образом, для исследованш гнилостно изменённого биологического материала.

Изолирование водой, подкисленной щавелевой кислотой

Идея изолирования подкисленной водой высказывалась разными исследователями. Так ещё в 1856 году С. Макадам предложил для подкисления воды использовать щавелевук кислоту, в 1861 г. Усляр и Эрдман - соляную, а в 1865 г. Г. Драгендорф - серную. Вплоть да 1941 г. водный метод не получал широкого распространения. В 1942 - 1943 г.г. Степановы» А.В. и Швайковой М.Д. был предложен метод изолирования алкалоидов из объекта растительного происхождения водой, подкисленной щавелевой кислотой (ускоренный метод) В 1947 - 49 г.г. этот метод был применён А.А. Васильевой к трупному материалу, после чего oн вошёл в практику судебно-химического анализа в отечественных лабораториях. На примере кониина можно представить следующим уравнением:

Схема изолирования по методу Васильевой заключается в следующем:

* Настаивание измельчённого  объекта с водой, подкисленной  щавелевой кислотой до рН = 2 - 3, в течение двух часов. Вода  берётся в количестве 1 : 2 по отношению к навеске объекта. Водное извлечение фильтруется.

* Экстрагирование веществ  кислого, нейтрального и слабоосновного  характера и водного фильтрата  хлороформом при рН = 2 (трёхкратная  экстракция), отделение органической  фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием (фракнш А, «кислое» извлечение).

* Подщелачивание оставшегося  после разделения фаз водного  слоя растворои аммиака до  рН 9 - 10, экстрагирование веществ  основного характера трёхкратной  экстракцией хлороформом, отделение органической фазы и концентрирован» упариванием (фракция Б, «щелочное» извлечение).

По сравнению с изолированием подкисленным спиртом извлечение водой подкисленной щавелевой кислотой.

Преимущества:

1. Быстрота (анализ можно  провести в течение одного  рабочего дня).

2. Меньшее количество  операций, меньшие потери искомых  веществ (алкалоид! извлекаются на 30 - 40 %).

3. Экономичность и дешевизна, т.к. дорогой спирт заменён водой.

Недостатком метода: Является образование стойких эмульсий при экстрагирований веществ из водной фазы хлороформом, особенно при исследовании гнилостнол биоматериала, т.к. метод не предусматривает очистки извлечений.

Изолирование нейтральным ацетоном

Метод предложен проф. Карташовым В.А. (г. Барнаул) в 1990 году.

Измельченную навеску биологического материала массой 5 г экстрагируют 10 м ацетона в течение 10 минут, центрифугируют. Полученное извлечение сливают, операцию экстрагирования ацетоном повторяют ещё 2 раза по 5 мл. Извлечения объединяют.

К объединенному извлечению добавляют 20 мл 0,5 н раствора хлористоводородной кислоты, перемешивают и экстрагируют гексаном дважды. Гексановые извлечения, содержащие примеси, отбрасывают.

Из очищенного вводно-ацетонового извлечения (рН=1) эфиром экстрагируют вещества кислотного характера. Далее вводно-ацетновую фазу подщелачивают гидроксидом аммония до Рн=9, добавляют 5 г хлорида натрия (высаливающий агент) и экстрагируют вещества основного характера эфиром.

Преимущество метода:

1. Высокий выход ядовитых  веществ (до 60-70%). Это достигается  за счет использования в качестве экстрагента амфифильного растворителя - нейтрального ацетона, который извлекает вещества кислотного и основного характера как в ионизированной, так и в молекулярной формах. Высокий выход веществ позволяет уменьшить массу навески до 5 граммов, что упрощает операции и снижает расход реактивов и времени пробоподготовки.

 

Недостатки метода:

Ацетон, являясь амфифильным растворителем, извлекает из биоматериала большое количество примесей, что требует дополнительной очистки извлечения. К недостаткам метода относится и его многостадийность.

Твердофазная экстракция

Лекарственные и наркотические средства, поступающие на исследование, крайне редко являются индивидуальными соединениями. Нередко объектами исследования являются поступающие из незаконного оборота синтетические наркотические средства, которые производятся в подпольных лабораториях. В подавляющем большинстве случаев они имеют в своем составе различные наполнители и добавки (сахар, соли жирных кислот, крахмал, сода, тальк и др.), либо содержат загрязнения или промежуточные и побочные продукты синтеза, содержание же наркотически активного компонента в таких препаратах очень низкое.

При этом разделение, выделение, концентрирование и очистка целевых компонентов традиционными методами (например, жидкостной экстракцией) неэффективны, а иногда просто невозможны. Решение такого рода проблем возможно при применении на стадии пробоподготовки метода твердофазной экстракции, позволяющего осуществлять одновременное разделение, выделение и концентрирование целевых компонентов из биологических жидкостей и их экстрактов, лекарственных и нативных наркотических средств. Такой подход дает возможность получения веществ в чистом виде, что в дальнейшем позволяет проводить идентификацию методами ИК-, УФ- спектроскопии, ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ, методом хромато-масс-спектрометрии.

В основе метода твердофазной экстракции лежит принцип колоночной хроматографии, который основан на специфическом взаимодействии выделяемого из биоматериала компонента с сорбентом, находящимся в небольшом патроне. Патрон-картридж имеет полиэтиленовую оболочку, внутри которой находится сорбент, упакованный между двумя пористыми фильтрами. Патроны могут соединяться друг с другом, представляя более широкие возможности для их использования. Чаще всего для заполнения патронов применяют сорбенты на основе силикагеля и химически модифицированного силикагеля. Для модификации силикагеля используются вещества, содержащие различные функциональные группы (нитрильные, диольные, амино- карбокси - и сульфогруппы), а также алифатические (Ci -Са) и ароматические (фенильные) группы. Выбор соответствующего типа патрона связан со свойствами определяемого вещества и осуществляется по типу подобия.

Часто в практике ХТА используются отечественные патроны фирмы "Дианак", заполненные немодифицированным силикагелем (Диапак Силикагель) и силикагелем, модифицированным гексадецильными группами Си (Диапак С|6).

При использовании патронов Диапак для большинства веществ проводят следующие операции.

1.Активация - приведение  патрона в рабочее состояние путем промывки этиловым или метиловым спиртом (2-10 мл). Скорость пропускания 2,5 мл/мин.

2. Кондиционирование - пропускание  буферного раствора (ацетатного  или аммиачного) в зависимости  от исследуемых веществ. Объем  буферного раствора - 10 мл. Скорость пропускания 2,5 мл/мин.

3. Сорбция - пропускание исследуемого  раствора через патрон. Объем  пробы обычно 100 мл. Скорость пропускания 2,5 мл/мин.

4. Десорбция - удаление исследуемого  вещества с сорбента с помощью  воздуха шприцем или вакуумным насосом.

5. Элюирование образца  осуществляется реагентом, который  применялся на стадии активации. Объем элюента- 50-100 мл.

Высокая эффективность выпускаемых патронов позволяет использовать их для пробоподготовки широкого круга объектов - от лекарственных препаратов сложного состава до "уличных наркотиков" и биологических жидкостей (моча, кровь, сыворотка и т. д.), а также экстрактов биологических жидкостей.