Получение аминокислот

путем нарушения механизма обратной связи.

 

[9]

 

Особое техническое  значение приобрела ферментация  глутаминовой кислоты так называемыми  микроорганизмами дикого типа. Культивируют

бактерии в  стерилизованных ферментерах при 35°С, используя в качестве

источника углерода глюкозу или патоку и вводя в систему воздух и аммиак. Через 40 ч из культуры можно изолировать глутаминовую кислоту.

Выход составляет 50 кг аминокислоты на 100 кг введенной глюкозы. Глутаминовая кислота в форме моноглутамата натрия применяется в значительных количествах как вкусовое вещество и приправа в пищевой промышленности. При незначительной добавке глутамата заметно усиливается и улучшается естественный вкус мясных блюд.

Путем микробиологической ферментации получают основное количество глутаминовой кислоты и весь лизин. У этого процесса свои преимущества и свои недостатки. С одной стороны, в нем мало стадий и требуется относительно простая и универсальная аппаратура. С другой стороны, живые микроорганизмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к малейшему изменению условий, а концентрация целевого продукта получается низкой, что ведет к увеличению размеров аппаратуры. [10]

 

Аминокислоты, полученные микробиологической ферментацией.

Таблица 1

Микроорганизмы	Источники С, N	Полученные аминокислоты
Corynebacterium glutamicum	Глюкоза или  гидролизат крахмала, патока тростникового и свекловичного  сахара, аммиак, мочевина	Glu
Мутанты Brevibacterium flavum	Патока тростникового сахара и свекловичного сахара, гидролизат крахмала,  м-алканы, уксусная кислота	Lys, Val, Orn, Met, Trp, Glu
Мутанты Preudomonas Irifoli и Е. coli	Этанол, неорганические соединения азота	Lys, Arg, He
Serratia marcescens Род Corynebacterium Род Brevibacterium	Фумаровая кислота, аммиак Фенилмолочная кислота Нефть, нитрат аммония Фосфаты, сульфат  магния, хлорид марганца(11)	Asp   Phe Glu, Ala, Asp Lys, Arg, Туг
Candida lipopytica, E. coli и др.	Хлорид кальция  и сульфат железа(11) в следовых количествах	Gly, Trp, Pro, Ser

[1]

 

Известны два  способа получения аминокислот: одноступенчатый и двухступенчатый. Согласно первому способу, например, мутантный полиауксотрофный штамм - продуцент аминокислоты культивируют на оптимальной для биосинтеза среде. Целевой продукт накапливается в культуральной жидкости, из которой его выделяют согласно схеме.

 

 

 

Технологическая схема получения аминокислот.

1 - ферментатор,

2 - охладитель, 3,9 - рефрижераторы,

4 - емкость для предварительной обработки,

5 - центрифуга,

6 - вакуум - упариватель,

7 - аппарат прямой

8 - барабанный фильтр, А,Б - пути (при необходимости смыкающиеся),

10 - аппарат для ультрофилырации,

11 - емкость для консервации раствора фермента,

12 - мембранный фильтр,

13 - накопитель жидкого консерванта, 14-емкость для осаждения фермента,

15 - фильтр - пресс,

16 - распылительная сушилка,

17 - накопитель сухого концентрата.

В двухступенчатом способе  микроб - продуцент культивируют в  среде, где он получается и синтезирует  все необходимые ингредиенты для последующего синтеза (в идиофазу) целевого продукта.

Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются внутриклеточно, но после 1 - ой ступени клетки сепарируют, дезинтегрируют и применяют клеточный  сок. В других случаях для целей  биосинтеза целевых продуктов применяют  непосредственно клетки. [8]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.2. ХИМИЧЕСКИЙ  СИНТЕЗ

 

Химический  синтез позволяет получать соединения любой возможной структуры и обеспечивает получение природных аминокислот необходимой степени химической и оптической чистоты. Здесь используется непищевое минеральное сырье, достигается высокая концентрация продукта. Его недостатком является то, что в процессе синтеза образуется смесь из биологически активной L-формы и D-изомера аминокислоты. D- форма является балластом, так как она не усваивается животными и человеком. Некоторые D-формы аминокислот обладают токсическими свойствами. Разделение изомеров – дорогая и трудоемкая процедура.

Существует  много методов химического синтеза аминокислот, некоторые из них:

1. Аминолиз галогенкарбоновых кислот.

Старейший метод  синтеза аминокислот — нуклеофильное замещение галогена в легкодоступных галогенкарбоновых кислотах:

R - CHCl(Br) - СООН + NH3 - R - CHNH2 - СООН + NH4Cl(Br)

Впервые таким  путем в 1858 г. был получен глицин из монохлоруксусной кислоты. Выходы составляют 60 — 70%, если применять 10-кратный

избыток аммиака  и работать в присутствии карбоната  аммония. При этом

аминогруппа образующейся кислоты дает карбамат аммония R = CH(NH-СОО NH4), и это предохраняет ее от дальнейшего превращения во вторичные и третичные аминосоединения.

[11]

 

2. Синтез Штрекера.

Синтез аминокислот, предложенный в 1850 г. Штрекером, основан  на присоединении синильной кислоты  к карбонильной группе альдегида  в присутствии аммиака. Получающийся при этом нитрил α-аминокарбоновой

кислоты омыляется  далее в DL-аминокислоту:

 

В качестве побочных продуктов могут получаться иминодинитрилы

NH(CHR-CN)2, тринитрилы  и карбоновые кислоты; общий  выход при этом синтезе - 7 5 % .

Бухерер внес изменения  в синтез Штрекера: альдегид реагирует  со смесью цианида натрия и карбоната аммония (или мочевины) и дает легко изолируемый гидантоин, который затем расщепляется щелочным гидролизом:

Синтез Штрекера имеет большое значение для получения  в промышленности глутаминовой кислоты, метионина и лизина. Исходные альдегиды  получают из продуктов нефтехимического производства, и синтезы обычно ведут через гидантоины. По методу Дюпона исходят из ацетилена:

По методу Аджиномото получают DL-глутаминовую кислоту, исходя из акрилонитрила:

Расщепление рацемата по этому методу происходит самопроизвольной кристаллизацией при затравливании оптически чистыми кристаллами, причем выпавшая в осадок D-глутаминовая кислота после рацемизации снова вводится в процесс. В настоящее время в мире ежегодно производится -250000 т глутамата натрия, причем большую часть составляет продукт, полученный синтетически.

При техническом  синтезе лизина исходят из цианмасляного  альдегида, который получают присоединением ацетальдегида к акрилонитрилу:

Промышленное  производство DL-метионина (в 1977 г. произведено 100 000 т), который применяется главным образом как добавка в корм скоту, ведется по методу Штрекера из /3-метилмеркаптопропионового альдегида, который получают из акролеина и метилмеркаптана. В этом случае не требуется разделения энантиомеров, так как L- и D-метионин одинаково хорошо усваиваются животными.

[1]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.3. ПОЛУЧЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ ГИДРОЛИЗОМ БЕЛКОВОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ

 

При получении  аминокислот белки, прежде всего, расщепляют с помощью

основного, кислотного или ферментативного гидролиза. В классическом методе кислотного гидролиза  используют 6 н. НCL или 8 н. H2SO4. Время реакции от 12 до 72 ч в зависимости от строения белка. Очень устойчивы к гидролизу пептидные связи, образованные лейцином, изолейцином и валином. При этом триптофан разрушается полностью, серии и треонин до 10%,

Потери аминокислот, которые обусловливаются присутствием углеводов, могут быть снижены, если работу проводят в вакууме и применяют большой избыток кислоты.

В других методах  кислотного гидролиза используют смесь  пропионовой

кислоты с 12 н. НСL (время реакции при 160 °С 15 мин, при 130 °С 2 ч),

3 н. 4-толуолсульфокислоту или 3 н. меркаптоэтансульфоновую кислоту (время реакции при 110 °С 24 ч). Последний метод используется

специально для аналитических целей. Триптофан при этом сохраняется на 95%.

При щелочном гидролизе  с 6 н. раствором гидроксида бария в автоклаве (давление ~ 700 кПа) разрушаются гидроксиаминокислоты и цистеин, в то время как триптофан сохраняется.[12]

Очень легко  протекает ферментативный гидролиз белков. Для осуществления полного  гидролиза необходимо применение комбинации нескольких ферментов, что связано с высокой специфичностью протеаз. На практике применяют протеиназы животного и бактериального происхождения (эндопептидазы), такие, как трипсин, пепсин и папайи в комбинации со специфическими амино- и карбоксипептидазами. Нередко хорошие результаты получают, используя неочищенный фермент (сырой препарат), например панкреатин, который содержит все пищеварительные ферменты поджелудочной железы (используют при получении аспарагина и глутамина).

Выделение отдельных  аминокислот из белкового гидролизата не сопровождается никакими затруднениями в тех случаях, когда они содержатся в достаточно высоких концентрациях и заметно отличаются друг от друга по свойствам.

Глутаминовая  кислота, например, кристаллизуется прямо из концентрированного гидролизата, насыщенного хлористым водородом, цистин и тирозин отделяют благодаря их плохой растворимости в воде. Селективное отделение ароматических аминокислот удается выполнить с помощью адсорбции на активированном угле. Полученную при гидролизе смесь аминокислот лучше всего разделить хроматографически. Выделению отдельных компонентов предшествует обычно разделение на кислые, основные и нейтральные группы аминокислот, при этом большое значение имеют электрофорез и специфические ионообменники. Раннее распространенные методы разделения, такие, как фракционная перегонка эфиров (по Фишеру), экстракция моноаминокарбоновых кислот н-бутиловым или амиловым спиртом, осаждение гексоновых оснований лизина, аргинина и гистидина фосфорновольфрамовой кислотой или флавиановой кислотой, теперь имеют только второстепенное значение. [13]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.4. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ  МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ

 

В то время как  при ферментации аминокислот  присутствуют все ферменты микроорганизмов, при ферментативных синтезах используются изолированные или фиксированные на носителе ферменты для катализа заданного пути реакции. Так, при получении аспарагиновой кислоты путем присоединения аммиака к фумаровой кислоте используют L-аспартазу, при получении L-аланина из L-аспарагиновой кислоты — L-аспартат-β-декарбоксилазу.

Особенно большое  значение имеет синтез L-лизина из D, L-а-аминокапролактама с помощью L-аминокапролактамгидролазы, получаемой микробиологическим путем. В этом синтезе, проводимом как одностадийный процесс, остающийся D-a-аминокапролактам рацемизуется а-аминокапролактамрацемазой и таким образом, в конце полностью переводится в L-лизин.

[14]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.5. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКИХ ИЗОМЕРОВ АМИНОКИСЛОТ

 

Перспективным методом получения L-аминокислот является разделение рацематов аминокислот путем ассиметричного гидролиза их производных с использованием микроорганизмов, обладающих специфической L-ацилазной, L- амидазной, L- эстеразной активностью.

Ферментативное  разделение рацематов аминокислот  с L-ацилазами основано на избирательном гидролизе ацилированных производных L-аминокислот. При отщеплении ацильной группы L-аминокислоты становятся растворимыми и легко отделяются от малорастворимых ацилированных D-аминокислот. [8]

Некоторые протеолитические ферменты, например химотрипсин, проявляют высокую L-эстеразную активность. Амидазы гидролизуют амиды аминокислот с образованием L-аминокислот. Не прореагировавшие производные D-аминокислот могут быть подвергнуты рацемизации и вновь использованы для ферментативного разделения.

При культивировании  микроорганизмов с ацилазной, амидазной  и эстеразной активностью для  повышения выхода целевого продукта необходимо вводить в среду культивирования  индукторы синтеза соответствующих  ферментов. Индукторами в ряде случаев  являются вещества, близкие по природе к субстрату действия ферментов. Например, для ацилазы лизина – ε-ацетил-L-лизин.

У многих микроорганизмов, прежде всего грибных и дрожжевых  культур, ацилазы являются внутриклеточными ферментами. Поэтому для их использования  клетки необходимо предварительно подвергать дезинтеграции. [15]

 

 

 

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ