Шпаргалка по "Экологии"

Плазмидную  ДНК можно выделить, затем подходящий рестриктазой расщепить в 1-ом сайте, превратив тем самым кольцевую молекулу в линейную с липкими концами. Фрагменты любой чужеродной ДНК с липкими концами, уже при помощи лигаз можно “сшить” с плазмидной ДНК в общее кольцо. Рекомбинантную конструкцию вводят в бактерию, где она реплицируется. Откуда взят фрагмент экзогенной ДНК – значения не имеет. Можно вшивать даже искусственно синтезированные гены.

Если  мы внедрили плазмиду с фактором устойчивости к антибиотику, то E.coli будет давать колонию на субстрате с антибиотиком. Нетрансформированные E.coli расти не будут.

 

Трансформация и трансдукция

 

Мы познакомились  с процессом удвоения ДНК, когда  на одной цепи, как на матрице, выстраивается  другая цепь. Однако в природе существуют процессы, связанные с изменением структуры ДНК, но эти изменения  идут в других направлениях.

Трансформация – внесение в клетку генетической информации при помощи изолированной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Трансформация приводит к появлению у трансформированной клетки (трансформанта) и её потомства новых признаков, характерных для объекта — источника ДНК. Явление было открыто в 1928 английским учёным Ф. Гриффитом, наблюдавшим наследуемое восстановление синтеза капсульного полисахарида у пневмококков при заражении мышей смесью убитых нагреванием капсулированных бактерий и клеток, лишённых капсулы. Организм мыши в этих экспериментах играл роль своеобразного детектора, так как приобретение капсульного полисахарида сообщало клеткам, лишённым капсулы, способность вызывать смертельный для животного инфекционный процесс. В последующих экспериментах было установлено, что трансформация имеет место и в том случае, когда вместо убитых клеток к лишённым капсулы пневмококкам добавляли экстракт из разрушенных капсулированных бактерий. В 1944 О. Эйвери с сотрудниками (США) установил, что фактором, обеспечивающим трансформацию, являются молекулы ДНК. Эта работа — первое исследование, доказавшее роль ДНК как носителя наследственной информации.

Помимо  пневмококков, трансформация обнаружена и изучена на некоторых других бактериях.

Трансформацию у бактерий рассматривают как сложный процесс, включающий следующие стадии:

- фиксация молекул ДНК клеткой-реципиентом;

- проникновение ДНК внутрь клетки;

- включение фрагментов трансформирующей ДНК в хромосому клетки-хозяина;

- формирование "чистых" трансформированных вариантов.

Фиксация  ДНК происходит на особых участках клеточной поверхности (рецепторах), число которых ограничено. Связанная  с рецепторами ДНК сохраняет  чувствительность к действию добавленного в среду фермента дезоксирибонуклеазы, вызывающего её распад. Однако, спустя очень короткий срок (в пределах 1 мин) после фиксации, часть ДНК  проникает в клетку. Бактериальные  клетки одного и того же штамма резко  различаются по проницаемости для  ДНК. Клетки данной бактериальной популяции, способные включать чужеродную ДНК, называются компетентными. Число компетентных клеток в популяции незначительно и зависит от генетических особенностей бактерий и фазы роста бактериальной культуры. Развитие компетенции связывают с синтезом особого белка, обеспечивающего проникновение ДНК в клетку.

Средние размеры фрагментов ДНК, проникающих  в клетку, составляют 5×106 дальтон. Поскольку  в компетентную клетку может одновременно проникнуть ряд таких фрагментов, суммарная величина поглощённой  ДНК может быть примерно равна  размерам хромосомы клетки-хозяина. После проникновения в клетку двунитевой ДНК одна нить распадается до моно- и олигонуклеотидов, вторая — встраивается в хромосому клетки-хозяина путём её разрывов и воссоединений. Последующая репликация такой гибридной структуры приводит к выщеплению "чистых" клонов трансформантов, в потомстве которых закреплен признак, кодируемый включившейся ДНК.

Применение  трансформации позволило провести генетический анализ бактерий, у которых не описано иных форм генетического обмена (конъюгации, трансдукции). Кроме того, трансформация – удобный метод для выяснения влияний на биологическую активность ДНК физических или химических изменений её структуры. Разработка метода у кишечной палочки позволила использовать для трансформации не только фрагменты бактериальной хромосомы, но и ДНК бактериальных плазмид и бактериофагов. Этот метод широко используется для внесения в клетку гибридной ДНК в исследованиях по генной инженерии.

 

Трансдукция (от лат. transductio — перемещение) – перенос генетического материала из одной клетки в другую с помощью вируса, что приводит к изменению наследственных свойств клеток-реципиентов. Явление трансдукции было открыто американскими учёными Д. Ледербергом и Н. Циндером в 1952. Особые бактериальные вирусы – умеренные фаги в процессе вегетативного размножения способны случайно захватывать и переносить в другие клетки любые участки ДНК лизируемых, то есть разрушаемых ими, бактерий (общая, или неспецифическая, трансдукция). Длина переносимого (трансдуцируемого) отрезка ДНК определяется размером белковой оболочки фаговой частицы и обычно не превышает 1-2% бактериального генома. Переносимый отрезок может содержать несколько генов. Поскольку вероятность такой сцепленной трансдукции зависит от расстояния между генами в молекуле ДНК, образующей хромосому бактерии, явление трансдукции широко используется при составлении генетических карт хромосом бактерий. Генетический материал фага в таких трансдуцирующих частицах отсутствует; поэтому, вводя ДНК в клетку, они не осуществляют все остальные функции фага: не размножаются, не лизогенизируют клетку и не наделяют её иммунитетом к фагу. Внесённый фрагмент может существовать в клетке в виде дополнительной генетического элемента, обладающего функциональной активностью. Поскольку такой фрагмент не способен воспроизводиться, при каждом клеточном делении он передаётся лишь в одну из дочерних клеток. За исключением этой клетки свойства всего остального потомства остаются без изменений (абортивная трансдукция). В дальнейшем фрагмент может быть либо разрушен, либо включен в хромосому бактерии, заменив в ней гомологичный участок ДНК. В последнем случае новые признаки, приобретённые клеткой-трансдуктантом, будут свойственны всему потомству этой клетки (полная трансдукция).

Существует  группа бактериофагов, способных трансдуцировать  лишь определённые гены, расположенные  рядом с местом включения генома фага в хромосому бактерии при  лизогенизации (ограниченная, или специфическая, трансдукция). Такие трансдуцирующие фаговые частицы, образующиеся в результате случайного нарушения точности процесса выхода профага из бактериальной хромосомы, содержат молекулу ДНК, состоящую из остатка фагового генома и фрагмента бактериального генома. В большинстве случаев они не могут самостоятельно размножаться или лизогенезировать бактерии из-за утраты части фагового генома (до 30%). Генетический материал трансдуцирующих частиц может сохраняться в клетке в автономном состоянии или в качестве профага включиться в ДНК бактерии. Однако в обоих случаях часть потомства восстанавливает исходные свойства из-за утраты профага. Стабильная трансдукция достигается только в случае включения бактериального фрагмента профага в геном бактерии в результате обмена на гомологичный участок хромосомы.

Эписомы (от эпи... и греч. sóma — тело) – генетические факторы, способные находиться в клетке либо в автономном (в цитоплазме) либо в интегрированном (включенными в хромосому) состоянии; представляют собой молекулы ДНК. К эписомам относятся геном умеренного фага лямбда, половой фактор F, некоторые R-факторы, сообщающие бактериям устойчивость к определённым лекарств, веществам, и некоторые др. Эписомы не являются обязательными компонентами клеток и могут переходить из одного состояния в другое, что зависит от вида клеток. Например, геном умеренного фага лямбда в клетках кишечной палочки может находиться в интегрированном либо в автономном состоянии, а в клетках возбудителя брюшного тифа – только в автономном состоянии. Находясь в автономном состоянии, большинство эписом ведут себя как типичные плазмиды. Ряд авторов видит в эписомах переходное звено между структурами, определяющими хромосомную и нехромосомную наследственность.

 

ДНК- диагностика

 

     Организм человека является средой  обитания для сотен видов бактерий  и вирусов. С биологической  точки зрения организм человека  представляет собой целую систему  сосуществующих организмов-симбионтов. Далеко не все из симбионтов  патогенные. Без некоторых видов  бактерий человек просто не  способен существовать, их утрата  или снижение количества является  причиной развития ряда тяжелых  заболеваний. Расшифровка геномов  многих болезнетворных микроорганизмов  с идентификацией всех белков  поможет разработать методы предупреждения  и лечения инфекционных болезней.

Для развития инфекционного процесса большое значение имеет генетический статус самого хозяина. Например, отдельные индивидуумы являются носителями вируса иммунодефицита, но СПИДом не болеют. У этих лиц имеется мутация в гене, кодирующем поверхностный белок, ответственный за попадание вируса внутрь лимфоидных клеток. Плотность белка на поверхности клеток снижена, вирус удерживается, но внутрь не попадает. Частота гомозигот по этой мутации среди жителей Европы составляет около 1%, они имеют выраженную устойчивость к ВИЧ-инфекциям. Более устойчивыми оказываются и гетерозиготные носители мутации, в российской популяции их частота достигает 13%.

 

Собственно  цитоплазматическая наследственность

 

Известны  случаи,  когда сама цитоплазма, а  не органеллы и частицы, определяют некоторые свойства. Однако при этом наследование признака оказывается  нестабильным и его проявление затухает в течение одного или нескольких поколений.

При онтогенетической предетерминации наследование некоторых  признаков по материнской линии  обусловлено изменениями в цитоплазме, возникающими в ней под влиянием определённых внешних факторов. Воздействие повышенной температурой на неоплодотворённые яйца самок наездника приводит к изменению окраски тела у их потомства. Когда температурному воздействию подвергаются самцы, то подобного эффекта не наблюдается.

Существует  генетическая предетерминация.

Наиболее  яркий пример – наследование направления  завитка раковины у прудовика. Есть прудовики с правозакрученной (D) и левозакрученной раковинами (d). При этом типе наследования фенотип потомков соответствует генотипу матери, а не генотипу зигот, из которых они развиваются.

Таким образом, при нехромосомном типе наследование осуществляется по материнской линии  и не может характеризоваться  такими строгими количественными закономерностями, как ядерное.