Исследование антиоксидантной и антирадикальной активности меланиновых пигментов

 

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

Кафедра биохимии

 

 

ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ  И АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МЕЛАНИНОВЫХ  ПИГМЕНТОВ

 

 

 

Дипломная работа

студентки 5 курса

Власовой Ю.А.

 

Научный руководитель:

канд. биол. наук,

доцент 

Кукулянская Т.А.

 

 

 

«Допустить  к защите»

Зав. кафедрой биохимии

Кандидат  биол. наук, доцент

Семак И.В.                                   

«     »                                     2012 года

 

 

Минск 2012

Содержание

Список условных сокращений…………………………………………………….4

Введение……………………………………………………………………….........5

Глава 1. Обзор  литературы ………………………………………………………8

1.1. Меланин………………………………………………………………………….8

1.2. Протекторная активность меланина……………………………………….…11

Глава 2. Материалы  и методы……………………………………………………..17

2.1. Реактивы………………………………………………………………….…….17

2.2. Методы  исследований………………………………………………………....17

2.2.1. Спектральные  исследования………………………………………………..17

2.2.2. Выделение митохондриальной фракции печени крыс………………… 18

2.2.3. Определение содержания ТБК-активных продуктов в митохондриальной фракции печени крыс………………………………………………………….….. 19

2.2.4. Определение содержания белка по методу Петерсона…………………20

2.2.5. Перекисное окисление лецитина ………………………………………..…21

2.2.6. Перекисное окисление лецитина, индуцированное УФ-излучением………………………………………………………………………….22

2.2.7. Измерение активности СОД в реакции аутоокисления кверцетина…………………………………………………………………………. 23

2.2.8. Реакция пероксидазного окисления аминобифенилов …………………...24

2.2.9. Статистическая  обработка результатов……………………………….…26

Глава 3. Результаты и их обсуждение……………………………………….…..27

3.1. Изучение спектральных свойств меланина…………………………………27

3.2. Изучение влияния меланина на перекисное окисление липидов ………….…………………………………………………………………………....34

3.2.1.Изучение влияния меланина на перекисное окисление лецитина, индуцированное различными факторами………………………………………..34

3.2.2.Изучение  влияния меланина на перекисное  окисление лецитина под действием  ультрафиолетового излучения………………………………………..37

3.2.3.Изучение влияния меланина на ПОЛ в митохондриальной фракции печени крыс………………………………………………………………………………….39

3.3.Исследование влияния меланина на процесс аутоокисления кверцетина…………………………………………………………………………..41

3.4.Изучение влияния меланина на пероксидазное окисление аминобифенилов………………………………………………………………...….42

Выводы…………………………………………………………………………..….49

Список использованной литературы……………………………………………...50

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список условных сокращений

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФА - диметилформамид

ДОФА – диоксифенилаланин

О-ДА – орто-дианизидин

ПОЛ – перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

ТБК – тиобарбитуровая кислота

ТХУ – трихлоруксусная  кислота

УФ – ультрафиолет

ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная  кислота

ЭПР – электронный парамагнитный  резонанс

NADH – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

TEMED – тетраметилэтилендиамин

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Обширную  группу природных конденсированных фенолов составляют меланиновые пигменты, имеющиеся у всех живых организмов.

Как известно, окраска кожного покрова  животных и цветовое разнообразие растительных организмов обеспечивается наличием в  клетке меланинов, различающихся по химической природе и структуре  в зависимости от видовой принадлежности организма. До недавнего времени  исследования биохимической роли меланинов  в клетке проводились довольно пассивно. Принято считать, что помимо пигментной функции система синтеза меланина сопряжена с системой транспорта электронов по дыхательной цепи, поскольку  известно, что одним из метаболитов  обмена меланина является убихинон, который в процессе окисления-восстановления служит промежуточным звеном передачи электронов от цитохрома b цитохрому с.

Экспериментальные работы по изучению природы меланинов и особенностей их метаболизма выявили полифункциональность этих соединений [24]. Несмотря на то, что химическое строение природных меланинов до сих пор окончательно не установлено вследствие их чрезвычайно сложной полимерной структуры и большого разнообразия, фармакологические эффекты меланинов исследовались довольно интенсивно. Особые свойства этих пигментов, которые делают их похожими на молекулярные сита и ионообменные смолы, их высокая электронно-акцепторная способность, наличие стабильных свободных радикалов в высоких концентрациях и ярко выраженные полупроводниковые свойства позволяют успешно использовать меланины в медицине, фармакологии и других отраслях [24]. Обнаружено, что благодаря стабильному свободнорадикальному состоянию и способности обратимо окисляться и восстанавливаться меланины обеспечивают защиту организма от экстремальных условий, способных генерировать в живой клетке активные свободные радикалы, нарушающие процессы ее нормальной жизнедеятельности [12,28].

Исследование  антирадикальных и антиоксидантных свойств меланинов – важная задача в области биохимии. Меланины содержатся в клетках бактерий, растительных и животных организмов. И от знания свойств меланинов зависит успех экспериментаторов при работе с культурами клеток. Специфическое строение молекулы меланинов, способствующее проявлению полифункциональных свойств пигментов, обеспечивает надежную защиту клеточных систем от экзогенных факторов мутагенной и канцерогенной природы. [3,5,17]

На современном  этапе развития фотохимии меланинов  существует два пути реализации фотозащитной функции эумеланинов: путем простого экранирования лучистой энергии или в результате аккумуляции меланинами свободных радикалов. В последнем заключается антирадикальная активность меланина. Таким образом, меланины проявляют защитную функцию в условиях индукции вторичных свободных радикалов.[3] На сегодняшний день меланины являются довольно перспективными природными антиоксидантами. Они малотоксичны, химически инертны и обладают устойчивыми радикальными состояниями [3,5]. А это очень важно для обезвреживания активных форм кислорода.

Целью данной работы являлось изучение антиоксидантных и антирадикальных свойств меланина, полученного из чаги.

В соответствии с целью были поставлены следующие  задачи:

1. Изучить влияние меланина на интенсивность ПОЛ, индуцированного различными системами: системой Фентона, ионами Cu²⁺ и Fe ²⁺; Fe/аскорбатной системой, УФ-излучением.
2. Исследовать влияние меланина на процесс аутоокисления кверцетина, сопровождающийся генерацией супероксиданион радикала;
3. Провести изучение влияния меланина на интенсивность свободнорадикального окислительного процесса пероксидазного окисления орто-дианизидина.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Глава 1. Обзор литературы

1. Меланины

Меланины – это разветвленные  полимеры хиноидных соединений. Они состоят из индольных и фенольных мономеров, образующих комплексы с белками и углеводами. Меланины делят на эумеланины, феомеланины, алломеланины и склеротины. Меланины нерастворимы в воде и органических растворителях, а также в концентрированных кислотах. Зато растворимы в щелочах. Обесцвечиваются сильными окислителями.[3,5,17]

 

 

 

 

 

 

 

Рис.1. Фрагмент структуры меланина [5]

Эумеланин является преобладающей формой меланина и лучше изучен. Эумеланины представляют собой полиморфные азотсодержащие биополимеры черно-коричневого цвета. Они тесно связаны с белками через ковалентные связи [8]. Эумеланины ведут себя как полианионы, способные обратимо связывать катионы, анионы и полиамины. Уникальной чертой эумеланинов является их стабильное парамагнитное состояние, являющееся результатом того, что в состав этих соединений входят семихинонные группировки. Эти группировки также ответственны за окислительно-восстановительные способности пигмента в отношении кислородных радикалов и других редокс-систем. Физическая структура и электрические свойства эумеланинов делают их органическими полупроводниками [35,19].

Феомеланины имеют желтую, красную или коричневую окраску, содержатся в волосах и перьях. Главные единицы, из которых построены феомеланины, - остатки бензотиазина. Феомеланин растворим в щелочах и тесно связан с белками. Это хромопротеин с широкой вариабельностью содержания азота и серы [35].

Алломеланины – черные пигменты, являющиеся продуктами высших растений и грибов. У грибов они обнаруживаются в спороносном слое, в спорах и черных гифах некоторых плесневых грибов. Алломеланины содержат мало или вообще не содержат азота, и потому не могут быть полимерами индола. Они полимеры простых фенолов, таких как пирокатехин, и их хинонов, и рассматриваются как пирокатехиновые меланины. [5]

Грибные меланины занимают промежуточное  значение между растительными и  животными пигментами, содержание азота  в которых 5-8% и 0,3 – 0,7% соответственно. Содержание азота в грибных меланинах  составляет от 1 до 4,5%. В грибных клетках  меланины не только связаны с белками, являясь хромопротеидами, но и со структурными элементами клетки, образуя устойчивые комплексы с хитином. [9,14,21]

Склеротины представляют собой полимерные вещества, наиболее характерные для экзоскелета членистоногих. Они ответственны за затвердение и связанное с ним потемнение кутикулы у многих видов насекомых. Склеротин – это не простой продукт полимеризации хинонов, а белок, способный сополимеризоваться с хинонами, подобными дофахинону, а также с другими близкими к тирозину молекулами. [5]

В наружных покровах тела меланины обычно присутствуют в специфических клетках  – меланоцитах. Внутри них меланины могут быть локализованы в органеллах – меланосомах, и в ассоциации с белком в виде гранул различной формы.[5]

Предшественником эумеланинов и феомеланинов является тирозин. При биосинтезе алломеланинов главным образом используется пирокатехин. Биосинтез эумеланинов можно условно разделить на две стадии: ферментативное окисление тирозина и полимеризацию. Ферментативное образование пигментов меланинового типа из тирозина было впервые продемонстрировано с препаратом грибного фермента тирозиназы. Сначала тирозин последовательно окисляется до ДОФА и дофахинона, а последний циклизуется с образованием окрашенного в красный цвет дофахрома. Дофахром превращается затем в бесцветную 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновую кислоту, а затем в 5,6-дигидроксииндол. Он окисляется до индолил-5,6-хинона, и тот претерпевает полимеризацию. Так образуется меланиновая макромолекула. Тирозиназа – это полифенолоксидаза с ионом двухвалентной меди в качестве простетической группы.[5] Феомеланины синтезируются по упрощенному эумеланиновому пути.

Рис.2. Схема меланогенеза Рэпера-Мэзона [5]

 

2. Протекторная активность меланина

Меланин – это аккумулятор супероксид-анионов в клетке, которые возникают из-за воздействия ультрафиолета. Минорная часть супероксида восстанавливается до перекиси водорода гидрохиноновыми группами меланина. Меланины деполимеризуются под действием ультрафиолета. Поэтому снижается их способность к обратимым изменениям свободнорадикального состояния. Это фотозащитная функция. Также меланин обладает антиоксидантными, антирадикальными и полупроводниковыми свойствами. [3,5,17,26]

Меланины  осуществляют не только пассивную фотоэкранирующую функцию, но и могут участвовать в радикальных метаболических процессах, связанных с действием ультрафиолетовых квантов.[13,37]

Меланиновые пигменты, независимо от своего происхождения и структурных особенностей, характеризуются стабильным парамагнитным поглощением, близким по своим качественным характеристикам к поглощению свободного электрона. Это является показателем присутствия в меланинах структур с неспаренными свободными электронами.[13,19,22] При изучении парамагнитных свойств биологического материала обнаружилось, что ткани, содержащие меланин, имеют определенный постоянный сигнал ЭПР, что свидетельствует о наличии в биологических системах стабильных свободных радикалов. Было сделано предположение, что меланин представляет собой ловушку для неспаренных электронов. У хиноновых остатков меланина были найдены три возможных состояния окисления: гидрохинон (полностью восстановленная форма), семихинон (парамагнитный свободный радикал, продукт окисления) и хинон (двухэлектронный продукт окисления). Семихиноны известны как стабильные радикалы, и так как полимерный меланин содержит сложную ароматическую структуру, то было предположено, что энергия семихинона, как свободного радикала меланина, в значительной степени снижается из-за возможности возникновения резонанса. Таким образом, меланин может функционировать как ловушка потенциально опасных неспаренных электронов.[30,33,38]

Имеются многочисленные литературные данные об антиокислительной активности пигментов в отношении таких окислителей как перекись водорода, гипохлорит, перманганат калия, а также токсичных кислородных радикалов. В работе Jacobson et al. [6] приводятся данные о протекторном действии меланина из Wangiella dermatidis и Alternaria alternata от перманганата калия и гипохлорита. Однако устойчивостью к действию перекиси водорода обладал только меланин из Alternaria alternata. Меланизированные штаммы устойчивы к более высоким концентрациям оксидантов, чем их непигментированные мутанты. Летальная доза Н₂О₂ для меланизированных клеток была в 1000 раз выше, чем для мутантных. Подобные результаты были получены при изучении грибов Cryptococcus neoformans при воздействии на них гипохлорита и перманганата калия. Также было установлено, что меланин из этого гриба обладает антиоксидантной активностью в отношении супероксиданиона. Причем, он проявляет активность, альтернативную действию супероксиддисмутазы. Однако, если фермент эффективно функционирует при температуре ниже 37^оС, то меланин активен  при температуре выше 37^оС . Аверьяновым и сотр. изучалось действие кислородных радикалов на меланизированный патогенный гриб Pyricularia oryzae. В результате было установлено, что непигментированные мутанты не обладают патогенными свойствами и оказались намного чувствительнее к действию оксидантов. [6]