Исследование антиоксидантной и антирадикальной активности меланиновых пигментов

Антирадикальная способность ДОФА-меланина была исследована при облучении белков и липидов. Изучение изменения накопления парамагнитных центров полученных in vitro и облученных комплексов ДОФА-меланина с белком и липидами выявило, что при гамма-облучении ДОФА-меланина в зависимости от температуры могут возникать стабильные и нестабильные радикалы, которые по своей природе схожи с собственными радикалами пигмента. Авторы работы предположительно связывают появление радикалов двух типов с возможностью их миграции по отношению к меланиновой матрице. При этом количество парамагнитных центров в чистом меланине и меланине в смеси с альбумином изменяется примерно одинаково. Авторами отмечено ингибирующее действие меланина на процесс накопления свободных радикалов даже при 10% содержании пигмента в смеси с белком. [4]

Изучение отношения меланина к  образованию свободных радикалов  в липидах in vitro проводили при облучении смеси ДОФА-меланина с кардиолипином в условиях низких температур, так как известно, что сигнал ЭПР гамма-облученных липидов неустойчив при комнатной температуре. Полученные результаты показали, что добавление ДОФА-меланина к кардиолипину практически не влияет на скорость гибели ROO^- - радикалов кардиолипина. Авторы предполагают, что при низких температурах в условиях торможения молекулярного движения взаимодействия перекисных радикалов с молекулами меланина затрудняется. При более высоких температурах свободные радикалы липидов, индуцируемые гамма-излучением, неустойчивы и быстро исчезают, что не позволяет изучать их взаимодействие с меланином методом ЭПР. [4]

Протекторное действие меланина, как  правило, изучалось на моделях синтезированного ДОФА-меланина in vitro, что очень часто не отражает гомеостатический процесс в живом организме. Разумеется, что исследование механизмов действия пигмента на молекулярном уровне методически затрудняется при использовании клеточных и тканевых культур или других систем, наиболее приближенных к метаболическим процессам организма. С одной стороны, это можно объяснить сложностью структуры самого пигмента, с другой - его полифункциональностью и способностью принимать участие в различных процессах жизнедеятельности организма.[4]

Существование многочисленных  окисленных форм меланина было подтверждено демонстрацией электрохимического восстановления меланина ионами титана (III) и окислением меланина ионами трехвалентного железа и кислорода. Было показано, что меланин катализирует восстановление Fe(III) с помощью NADH, что подтвердило, что меланин может выступать в качестве медиатора при обмене электронами. Участие свободнорадикального семихинона в качестве промежуточной формы в ОВР было показано в электрохимических реакциях меланина из Aspergillus niger с помощью ЭПР. При постепенном окислении образца сигнал сначала усиливался, а затем угасал. Когда образец меланина восстанавливался до первоначального состояния, картина повторялась. Horak и Weeks [30] наносили слой меланина на карбоновый электрод путем электрохимического окисления раствора 5,6-дигидроксииндолила (предшественника ДОФА-меланина). Ученые изучали электрохимические свойства полученной синтетической пленки меланина при помощи циклического вольтметра.  В присутствии растворенного предшественника меланина (дигидроксииндолила) электрохимический потенциал инертного электрода изменялся с определенным периодом сначала в сторону с положительным знаком, потом – в сторону с отрицательным знаком. Предшественник постепенно окислялся и меланин все больше осаждался. И выяснилось, что буферная способность раствора тем лучше, чем толще пленка меланина.[30]

Было  показано, что ЭПР-сигнал меланинового образца возрастает в присутствии супероксид-анионов, и при этом происходит перенос неспаренных электронов от супероксида к меланину. Wang и Casadevall изучали защитное действие меланина от свободных радикалов кислорода и азота с использованием Cryptococcus neoformans. Свободнорадикальный кислород являлся продуктом катализируемой реакции Фентона, где Fe(III), H₂O₂ и адреналин генерировали гидроксил-радикал. Свободный радикал азота был получен путем обработки NaNO₃ соответствующей кислотой с образованием окиси азота. Из клеток, содержащих меланин, выжило приблизительно в 10 раз больше клеток, нежели из тех, что меланин не содержали.[30]

При исследовании антирадикальной активности меланина из криптококков было установлено, что ЭПР-сигнал до некоторой степени возрастал, когда клетки, содержащие меланин, инкубировались в растворе с монооксидом азота, а когда те же клетки обрабатывали реактивом Фентона, усиливался, но очень незначительно. Авторы предположили, что результаты отражают перемещение неспаренных электронов к молекуле меланина. Исследования продолжались, уже с использованием полученного мутантного штамма, содержащего 1,5%  фенолоксидазной активности, присущей дикому типу.  Во время роста мутантного штамма на среде с предшественником меланина (L-ДОФА) устойчивость штамма возрастала по отношению к монооксиду азота, но не возрастала устойчивость к гидроксил-радикалу. Таким образом было сделано предположение, что для защиты клеток от окиси азота нужно очень небольшое количество меланина, в то время как для защиты от супероксид-радикал- генерирующей системы меланина необходимо гораздо больше.[30]

Polacheck и др. ранее изучали чувствительность грибов к окислителям, которые образуются в системе Фентона, катализируемой ионами металлов. Даже если бы они обнаружили, что мутанты C. neoformans со скудным содержанием меланина проявляют похожую чувствительность, и приписали бы результат к феномену недостаточной меланизации, недостаток экзогенных катехоламиновых предшественников меланина в процессе роста культур в преддверии эксперимента исключил бы синтез должного количества меланина, даже у штаммов дикого типа, так как для C. Neoformans необходимо присутствие экзогенных катехолов для образования меланина в клетках.[30]

Так как  меланин подвергается моноэлектронным окислениям и восстановлениям в рамках трех стабильных состояний, можно ожидать перехода электронов от одних молекул к другим. И было показано, что in vitro реакция дисмутации супероксида облегчается. Реципрокное взаимодействие между клеточным меланином и супероксиддисмутазой было описано у лягушки и у C. neoformans. Можно предположить, что повышенное содержание меланина может компенсировать сниженную концентрацию супероксиддисмутазы.[29,31]

Меланиновым пигментам присущи многие защитные функции в организме, обусловленные особенностями их строения. Меланины являются ловушками свободных радикалов, они инактивируют активные формы кислорода, возникающие вследствие воздействия УФ-излучения, являются сорбентами различных токсических соединений, и имеет смысл изучать дальнейшие возможности использования меланинов в качестве антиоксидантов.

 

 

 

 

 

Глава 2. Материалы и методы

1. Реактивы

В работе были использованы следующие материалы  и реактивы:

Меланин, NaOH, Н₂O₂ 10%, дитионит натрия, ТБК,

NaH₂PO₄ * 2H₂0, Na₂HPO₄ * 12H₂0, FeSO₄*7H₂0, CuSO₄*5H₂O,

лецитин («Sigma», США), хлороформ, этанол, кверцетин,

ДМСО, ЭДТА, TEMED («Aldrich», США), бычий сывороточный альбумин (“ДиаМ”, Австралия), NADPH («Reanal», Венгрия), аскорбат, сахароза, Na/K-виннокислый, SDS, реактив Фолина-Чокальтеу, додецилсульфат натрия, лимонная кислота, ацетат натрия, Na₂CO_3,пероксидаза хрена («Sigma», США), Tween 20, ДМФА.

Реактивы, использованные в работе, имели марку  «ЧДА», «ХЧ» или «ОСЧ».

Меланин из чаги, использованный в работе, был  любезно предоставлен для исследований НИЛ прикладных проблем биохимии.

 

 

2. Методы исследований

Все эксперименты выполнялись в  соответствии с этическими нормами  обращения с животными, а также  правилами проведения работ с  использованием лабораторных животных в научных исследованиях на биологическом  факультете БГУ, составленными на основании  рекомендаций и требований «Всемирного  общества защиты животных» и «Европейской конвенции по защите экспериментальных  животных» (Страсбург, 1986).

1. Спектральные исследования

Спектральные исследования проводили  на спектрофотометре СФ-46 (l =1см) кюветах в диапазоне λ=340-620 нм. Регистрация спектров поглощения растворов меланина и растворов меланина в присутствии 10%-ого пероксида водорода  и дитионита натрия до и после облучения УФ проводилась с шагом измерения 10 нм. Все измерения проводились не менее трех раз.

2.2.2. Выделение митохондриальной фракции печени крыс [15]

Выделение митохондриальной фракции производилось из печени беспородных белых крыс-самцов массой 200-250 г, содержащихся на стандартном рационе вивария Белгосуниверситета.

В ходе выделения  микросом были использованы следующие  реагенты:

• Среда выделения митохондрий: 0,25 моль/л раствор сахарозы, содержащий 1 ммоль/л раствор ЭДТА.

Животных  декапитировали, вскрывали брюшную полость, печень изолировали, промывали в охлажденной среде выделения и измельчали ножницами в чашке Петри, стоящей во льду. Навески ткани массой 1 г подвергали гомогенизации в гомогенизаторе Даунса с тефлоновым пестиком (в течение 1 мин 20-30 движениями пестика) в охлажденной среде выделения митохондрий при отношении массы ткани к объему раствора как 1 : 3. Полученный гомогенат центрифугировали в угловом роторе на центрифуге 3Кх30 «Sigma» в течение 10 мин при 600 g для удаления обломков клеток и ядерной фракции. Супернатант подвергали дальнейшему центрифугированию в угловом роторе на центрифуге 3Кх30 «Sigma» в течение 10 мин при 14 000 g при температуре 4^оС. Полученный осадок митохондрий суспендировали пипетированием в охлажденной среде выделения в расчете 1 мл среды на 1 г сырой ткани.

 

 

 

 

 

 

2.2.3. Определение содержания ТБК-активных продуктов в митохондриальной фракции печени крыс [16]

Метод основан на том, что при высоких температурах и низком pH малоновый диальдегид реагирует с ТБК, образуя окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 532 нм. Молярный коэффициент экстинкции этого комплекса – ε = 1,56*10⁵ см^-1М^-1.

В состав реакционной среды входили: 0,5 мл митохондриальной фракции с концентрацией белка ~2 мг/мл и 0,5 мл Fe/аскорбатной системы (0,9% NaCl;10 мМ FeSO₄;30 мМ NADPH;100 мМ аскорбат). В состав контроля вместо митохондриальной фракции вносили 50 мМ фосфатный буфер (рН 7,4).

Пробы инкубировали на водяной бане при 37 ^oC в течение 30 мин, после чего добавляли по 0,5 мл 30%ТХУ для остановки реакции и осаждения белка. Сразу же после этого в пробы вносили по 2 мл 0,8%ТБК и ставили на 15 мин в кипящую водяную баню. После кипячения пробы охлаждали до комнатной температуры и образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 4000 g. Далее измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости при 532 нм с использованием спектрофотометра “Solar PV 1251 c” (пластиковая кювета, l =1см) против контрольной пробы.

Количество  малонового диальдегида рассчитывали с помощью коэффициента молярной экстинкции: (ε = 1,56*10⁵ см^-1М^-1).

Рассчитывали  содержание ТБК-активных продуктов на 1 мг белка в пробе (предварительно определяли содержание белка методом Петерсона).

Для изучения влияния меланина на процесс индуцированного ПОЛ в реакционную смесь вносили растворы меланина (в различных концентрациях) до инкубации.

 

 

 

 

2.2.4. Определение содержания белка по методу Петерсона [16]

Реактивы:

1. Раствор бычьего сывороточного альбумина, содержащего 100 мкг белка в 1 мл;
2. СТС реактив: 0,1% CuSO₄*5H₂O, 0,2% р-р Na/K-виннокислого, 10% р-р Na₂CO₃;
3. 5% р-р SDS;
4. 0,8 моль/л р-р NaOH;
5. 2н реактив Фолина-Чокальтеу.

Реагент А: 1 часть СТС-реактива смешивали с 1 частью 0,8 моль/л р-ра NaOH, после чего в полученную смесь доливали 2 части 5% р-ра додецилсульфата Na.

Реагент В: 1 часть реактива Фолина-Чокальтеу смешивали с 5 частями воды.

Ход работы:

Для построения калибровочного графика из стандартного раствора альбумина готовили растворы белка, содержащего 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг альбумина в 1 мл. К 1 мл исследуемого раствора, содержащего от 10 до 100 мкг белка, приливали 1 мл реагента А, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 10 минут. Затем в пробирку с реакционной смесью добавляли 0,5 мл реактива В, перемешивали и через 30 минут определяли оптическую плотность раствора при 670 нм с помощью спектрофотометра “Solar PV 1251 c”.

Содержание  белка рассчитывали по полученному калибровочному графику.

 

 

 

 

 

Рис.3. Калибровочный  график для определения содержания белка по методу Петерсона.

 

 

2.2.5. Перекисное окисление лецитина

При высокой  температуре в кислой среде продукт  ПОЛ – малоновый диальдегид – реагирует с ТБК, образуя окрашенный триметиновый комплекс, концентрацию которого определяли спектрофотометрически на спетрофотометре “Solar PV 1251 c” при λ = 532 нм, используя ε = 1,56*10⁵  см^-1М^-1.

В качестве субстрата перекисного окисления использовали 1% раствор лецитина в смеси растворителей этанол:хлороформ (1:1).

Были использованы три системы индукции: система Фентона, система, содержащая ионы железа Fe²⁺, и система, содержащая ионы меди Cu²⁺. Реакцию проводили в фосфатном буфере (pH=7,4).

Система Фентона состояла из следующих компонентов:

- фосфатный буфер – 9,8 мл

- 100мМ FeSO₄ – 100 мкл

- 10мМ Н₂О₂ – 100 мкл

В среду инкубации (V=1 мл), содержащую фосфатный буфер и FeSO₄ , вносили 1%-ый раствор лецитина (5 мг/мл). Реакцию запускали внесением Н₂О₂.

Для изучения влияния меланина на интенсивность ПОЛ проводили  преинкубацию реакционной смеси, содержащей лецитин и FeSO₄ в фосфатном буфере, с меланином (167 мкг/мл, 333 мкг/мл, 500 мкг/мл, 667 мкг/мл, 833 мкг/мл) в течение 5 минут.