Исследование антиоксидантной и антирадикальной активности меланиновых пигментов

 

Рис.9. Влияние различных систем индукции ПОЛ на содержание образовавшихся ТБК-активных продуктов в зависимости от содержания 1%  раствора меланина в пробе.

Рис.10. Влияние ионов Fe²⁺ на содержание образовавшихся ТБК-активных продуктов в зависимости от содержания 1%-ого  меланина в пробе.

 

Можно предположить, что  меланин, добавленный в систему  с ионами железа, более интенсивно ингибирует накопление ТБК-активных продуктов, по сравнению с пробами, где, вместо ионов железа, была использована система Фентона. Как известно, концентрация ТБК-активных продуктов отражает степень ПОЛ. Чем больше этих продуктов (малонового альдегида, в частности), тем сильнее окисляются липиды.

При проведении преинкубации ионов железа с меланином последующее внесение их в реакционную смесь, содержащую лецитин, не приводило к столь значительной индукции ПОЛ, а ингибирующее действие меланина было выражено более значительно.

При использовании  в качестве системы индукции ПОЛ  ионов двухвалентной меди были получены следующие результаты:

Рис.11. Влияние ионов Cu²⁺ на содержание образовавшихся ТБК-активных продуктов в зависимости от содержания 1%-ого  меланина в пробе.

Из рис. 11 видно, что при проведении преинкубации ионов меди с меланином последующее внесение их в реакционную смесь, содержащую лецитин, не приводило к столь значительной индукции ПОЛ, в отличие от проб, где преинкубация не производилась, а ингибирующее действие меланина было выражено более значительно.

Таким образом, можно предположить, что меланин обладает способностью хелатировать ионы двухвалентных железа и меди, снижая тем самым их способность индуцировать ПОЛ.

 

3.2.2. Изучение влияния меланина на перекисное окисление лецитина под действием ультрафиолетового излучения

В литературе имеются данные, что  между накоплением продуктов  окисления липидов (среди которых  преобладает малоновый диальдегид) и временем облучения ультрафиолетом существует линейная зависимость. Было показано, что этот ингибирующий эффект сильно зависит от вида меланина и усиливается при увеличении концентрации меланина. [32]

Способность ингибировать перекисное окисление липидов зависит как  от концентрации парамагнитных центров  в полимерах меланина, так и  от доступности этих центров для  свободных радикалов. [32]

При проведении реакции перекисного  окисления лецитина под действием  ультрафиолетового излучения нами были получены следующие результаты.

 

Рис.12. Влияние УФ как индуктора ПОЛ на содержание образовавшихся ТБК-активных продуктов в зависимости от содержания 1%  меланина в пробе.

Как видно из гистограммы на рис.12, содержание ТБК-активных продуктов на 1 мг лецитина в пробе уменьшается с возрастанием концентрации меланина. Причем накопление продуктов ПОЛ при облучении системы в течение 15 минут ингибируется в большей степени, нежели при облучении в течение 5 минут.  Можно предположить, что меланин в конечной концентрации 33-133 мкг/мл проявляет прооксидантное действие. Ранее нами было показано, что облучение меланина УФ в течение 5 минут не приводит к существенным изменениям его спектральных характеристик, а облучение в течение 15 минут способствует заметному уменьшению оптической плотности растворов меланина.

 

 

 

 

3.2.3. Изучение влияния меланина на ПОЛ в митохондриальной фракции печени крыс

 

Хорошо известным является тот  факт, что процесс перекисного  окисления липидов является важной причиной накопления клеточных дефектов. Основным субстратом ПОЛ являются полиненасыщенные цепи жирных кислот, входящих в состав клеточных мембран, а также липопротеинов. Под действием активных форм кислорода происходит образование гидрофобных радикалов, взаимодействующих друг с другом. Образующиеся липидные радикалы, а также 4-гидроксиноненаль и малоновый диальдегид, могут реагировать с молекулами белков и нуклеиновых кислот. Альдегидные группы этих соединений образуют межмолекулярные сшивки, что сопровождается нарушением структуры макромолекул и дезорганизует их функционирование. В конечном счёте, окисление липидов приводит к ряду тяжёлых последствий. [1,2]

В литературе имеются данные о том, что меланины могут проявлять антиоксидантные свойства. Причём, проявление данных свойств зависит не только от структурных особенностей, но и от концентрации меланина.

При изучении влияния меланина на перекисное окисление липидов мембран митохондрий печени крыс были получены следующие результаты.

 

 

 

 

 

Рис.13. Влияние Fe/аскорбатной системы индукции ПОЛ на содержание образовавшихся ТБК-активных продуктов в зависимости от содержания 1%  раствора меланина в 0,01 Н NaOH в пробе.

 

Переходные  металлы часто вовлекаются в  генерацию свободных радикалов  посредством разложения пероксида водорода или гидропероксидов липидов, с образованием гидроксильного радикала или алкоксильного радикала соответственно. Меланин, хелатируя металл, может таким образом предотвратить формирование свободных радикалов.

Можно предположить, что  меланин в возрастающих концентрациях эффективнее проявляет антиоксидантные свойства, ингибируя индуцированное перекисное окисление липидов и снижая уровень спонтанного ПОЛ.

 

 

 

 

 

3.3. Исследование влияния меланина на процесс аутоокисления кверцетина

Ряд соединений, содержащих в своей структуре  ароматические кольца, способен окисляться в щелочной среде. Процесс аутоокисления сопровождается генерацией супероксиданион-радикала. [39]

 

Нами было изучено влияние меланина на процесс генерации супероксид-анион радикала в системе аутоокисления кверцетина. Влияние меланина оценивали по способности ингибировать этот свободнорадикальный окислительный процесс. Были получены следующие результаты.

 

Рис.14. Влияние меланина на процесс аутоокисления кверцетина

При содержании меланина в  реакционной смеси в низких (33 – 167 мкг/мл) концентрациях его антиоксидантная активность менее выражена, чем тогда, когда меланин в пробах присутствует в более высоких концентрациях. Можно предположить, что меланин инактивирует супероксиданион-радикал, возникающий при аутоокислении кверцетина, проявляя таким образом свою антиоксидантную и антирадикальную активность.

 

3.4. Изучение влияния меланина на пероксидазное окисление аминобифенилов

 

Основными реакциями биотрансформации аминобифенилов являются процессы их окисления с участием пероксидаз и монооксигеназ. В ходе пероксидазного окисления бензидина и его производных образуются высокореактивные производные [7,27], которые могут навредить клетке.

Бензидин в ходе пероксидазного окисления теряет последовательно два электрона и превращается в хиноидное соединение.  Продукты метаболической активации способны взаимодействовать с донорами электронов мономеров ДНК. Благодаря большой реакционной способности N-7-гуанина в ДНК возможно его алкилирование агентами с двумя реакционноспособными центрами, такими как комплекс с переносом заряда. В результате этой реакции должно происходить образование ковалентных межнитевых сшивок ДНК. Эти повреждения являются мерой генотоксичности бензидина и его производных. [7]

Пероксидаза хрена использует перекись водорода в окислении производных бензидина с образованием окрашенных продуктов. [23]

Меланин способен связывать свободные радикалы окисленных аминобифенилов.

Меланин представляет собой полифенольный  комплекс с большой молекулярной массой и проявляет хелатирующие и антирадикальные свойства.

При исследовании пероксидазного окисления о-ДА реакцию начинали добавлением перекиси водорода и в течение 3 мин регистрировали рост поглощения продукта окисления при соответствующей длине волны. Значения начальной скорости определяли по начальным, строго линейным участкам кинетических кривых. [10] Кинетические кривые образования продукта окисления о-ДА в присутствии возрастающих концентраций меланина показаны на рис.15, из которого видно, что меланин ингибирует окисление о-ДА пропорционально увеличению своей концентрации в пробе. А начальная скорость реакции уменьшается по мере возрастания концентрации меланина.

Возможный механизм ингибирования заключается  во взаимодействии меланина с радикальными продуктами окисления о-ДА.

Начальные скорости реакции пероксидазного окисления о-ДА в присутствии возрастающих концентраций меланина отражены в таблице 1.

 

Таблица 1.

Начальные скорости реакции пероксидазного окисления о-ДА в присутствии различных концентраций меланина

 

t, сек	Концентрация продуктов окисления о-ДА, С*10-4, моль/л
	[мел.], мкг/мл 0	[мел.], мкг/мл 33	[мел.], мкг/мл 67	[мел.], мкг/мл 100	[мел.], мкг/мл 133	[мел.], мкг/мл 167	[мел.], мкг/мл 200	[мел.], мкг/мл 233	[мел.], мкг/мл 267	[мел.], мкг/мл 300	[мел.], мкг/мл 333
Нач. скор. *10-8 моль/ (л*с)	58,7	41,8	27,3	20	17,3	18,7	16	14,7	13,3	11,3	9,3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.15. Зависимость концентрации продукта пероксидазного окисления о-ДА от времени при различных концентрациях меланина.

 

Результаты  изучения пероксидазного окисления о-ДА в присутствии меланина, проинкубированного с ионами (II) железа, отражены на рис.16. Можно предположить, что меланин, проинкубированный с сульфатом железа (нижняя часть рисунка) сильнее ингибирует процесс окисления о-ДА, по сравнению с ситуацией, где меланин в пробах отсутствовал (верхняя часть рисунка). Кроме того, замечено, что ионы железа в очень низких концентрациях (0,927 мкг/мл) значительнее замедляют процесс пероксидазного окисления о-ДА, по сравнению с меланином, проинкубированным с ионами Fe²⁺.

Начальные скорости реакции пероксидазного окисления о-ДА в присутствии Fe²⁺ отражены в таблице 2. Начальные скорости реакции пероксидазного окисления о-ДА в присутствии меланина, проинкубированного с ионами (II) железа, показаны в таблице 3.

 

 

Таблица 2.

Начальные скорости реакции пероксидазного окисления о-ДА в присутствии Fe²⁺

t, сек	Концентрация продуктов окисления  о-ДА, С*10-4, моль/л
	[Fe2+] (0,927мкг/мл)	[Fe2+] (9,27мкг/мл)	[Fe2+] (93 мкг/мл)	[Fe2+] (463 мкг/мл)	[Fe2+] (927мкг/мл)
Нач.скор.*10-8 моль/ (л*с)	28	6	63,3	57,3	2,7

 

 

Таблица 3.

Начальные скорости реакции пероксидазного окисления о-ДА в присутствии меланина (167 мкг/мл) и Fe²⁺

t, сек	Концентрация продуктов окисления  о-ДА, С*10-4, моль/л
	[Fe2+] (0,927мкг/мл)	[Fe2+] (9,27мкг/мл)	[Fe2+] (93 мкг/мл)	[Fe2+] (463 мкг/мл)	[Fe2+] (927мкг/мл)
Нач. скор. *10-8 моль/ (л*с)	20	18,7	24,7	3,3	1,3

 

 

 

 

Рис.16. Зависимость концентрации продукта пероксидазного окисления о-ДА от времени при различных концентрациях Fe²⁺.

 

 

 

Результаты  изучения пероксидазного окисления о-ДА в присутствии меланина, проинкубированного с ионами (II) меди, отражены на рис.17. Можно сделать предположение о высокой способности меланина хелатировать ионы (II) меди и в таком состоянии ингибировать реакцию пероксидазного окисления о-ДА.

Начальные скорости реакции пероксидазного окисления о-ДА в присутствии Cu²⁺ отражены в таблице 4.

Таблица 4.

Начальные скорости реакции пероксидазного окисления о-ДА в присутствии ионов Cu²⁺