Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

 

 

                               МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ,

                   ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ

 

      

                                                                                                      

                                  

                                                    

 

 

 

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

   

 

                        Раздел 1. Культивирование вирусов

 

         1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований

 

             1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории

     В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению штаммов вирусов, их идентификации и культивированию, выполняются различные научные исследования. При работе с вирусами необходимо прежде всего:

1. Не допустить загрязнения штаммов вирусов посторонней микрофлорой;
2. Обеспечить безопасность работающего персонала от возможного заражения вирусами;
3. Обеспечить безопасность окружающего населения от заражения вирусными инфекциями через сточные воды, трупы экспериментальных животных и т.п.

    Методы исследования, применяемые в вирусологии отличаются  значительной сложностью, что связано  прежде всего с абсолютным  внутриклеточным паразитизмом вирусов  и их малыми размерами.

    При исследовании  материалов, полученных от больных  вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы:

• Методы электронной и в меньшей степени световой микроскопии;
• Методы выделения и культивирования вирусов в культурах клеток;
• Методы выделения и культивирования вирусов в развивающихся куриных    эмбрионах и в организме чувствительных экспериментальных животных;
• Выявление вирусов по их гемагглютинирующей способности;
• Различные серологические методы исследования: традиционные и экспресс-методы;
• Молекулярно-генетические методы исследования – молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция.

                 1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях

     При взятии инфекционного  материала от людей и животных  необходимо учитывать тропизм  вирусов к определённым тканям и органам, пути выделения вируса во внешнюю среду и особенности патогенеза той или иной вирусной инфекции.

      Различают пневмотропные,  энтеротропные, гепатотропные, лимфотропные, нейротропные и дермотропные  вирусы. В зависимости от тропизма исследованию подвергают различные материалы. Например, исследуют слизь из зева, мокроту и т.п., если виру пневмотропный; испражнения – при энтеротропных вирусах; жидкость из визикул или пустул, корочки – если вирус обладает дермотропностью и т.д.

                1.1.3. Обработка вируссодержащего материала

       Инфекционные  материалы, взятые с учётом  тропизма вирусов и с соблюдением  асептики, помещают в стерильную  посуду, тщательно закупоривают  её и направляют в лабораторию,  поместив в термос со льдом.

       Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы быстро инактивируются. Сохранению вируса способствует помещение исследуемого материала (в 50%-ном растворе глицерина) в холодильник при температуре не выше 5^оС. Но самый надёжный способ – это хранение в замороженном состоянии при температуре -45^оС и ниже; в таких условиях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время.

         Обработка плотного материала,  содержащего вирусы, начинается  с растирания его в ступке  или измельчения в специальных аппаратах – гомогенизаторах. Затем готовится 10%-ная взвесь в солевом растворе, которую центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-30 минут для осаждения крупных частиц. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию.

        Жидкий вируссодержащий материал  непосредственно центрифугируют  и также получают надосадочную  жидкость.

        Если есть сомнения в бактериологической  стерильности исследуемой вируссодержащей  надосадочной жидкости, к ней  добавляют антибиотики, чтобы уничтожить посторонние микроорганизмы. Антибиотики не влияют на вирусы, и они сохраняют свою жизнеспособность.

              1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии

-  Электронная микроскопия

Электронноскопические препараты готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражённых вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плёнки-подложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-подложки должны быть очень тонкими (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными, например, коллоидийно-угольные. Плёнки наносят на поддерживающие сеточки из меди (диаметром 2-3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами.

Методы напыления металлами применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на вируссодержащий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла.

Метод негативного контрастирования основан на том, что при обработке препарата некоторыми солями тяжёлых металлов, например, 1-2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, создаётся более плотный слой, не пропускающий электроны, а котором хорошо видны более электроннопрозрачные исследуемые объекты.

Метод ультратонких срезов в сочетании с негативным контрастированием является наилучшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этапов взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиболее сложен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодержащего материала фиксируют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обезвоживают путём последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной 10-20 нм на специальном микротоме, Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Приготовленные вышеописанными способами  препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая  способность которого достигает 0,2-0,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюаресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Получаемые увеличения: ×100000-×400000.

Сканирующая электронная  микроскопия осуществляется с помощью сканирующего электронного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, проходя через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изображение объекта на флюоресцирующем экране.

Сканирующая микроскопия позволяет получать трёхмерное изображение вирионов (предварительно препарат напыляют металлами), различать детали строения их поверхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующего микроскопа равна 7-20 нм.

- Световая микроскопия

В световом микроскопе можно  увидеть крупные вирусы, размеры  которых находятся в пределах разрешающей способности микроскопа -  не менее 0,2 мкм. А также внутриклеточные включения в поражённых вирусом тканях.

Крупные вирусы, например, поксвирусы, и включения обнаруживают с помощью специальных методов окраски, в фазовом контрасте, в тёмном поле зрения; применяют и люминесцентную микроскопию.

Крупные вирусы выявляют путём окраски  по Морозову (серебрением). Для выявления  внутриклеточных включений приготавливают гистологические срезы из поражённых тканей, препараты-мазки или отпечатки. Обычно препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе, иногда другими методами. Наибольшее практическое значение имеет обнаружение включений Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга при бешенстве. Для этого препараты окрашивают по Манну.

Люминесцентная микроскопия. Препараты, приготовленные из материалов, содержащих крупные вирусы, внутриклеточные включения, скопления вирусных антигенов, окрашивают растворами флюорохромных красителей. При люминесцентной микроскопии в УФ-свете окрашенные акридин-оранжевым скопления РНК-геномных вирусов и образуемые ими включения видны как светящиеся красные гранулы на фоне бледно-зелёной цитоплазмы клеток; ДНК-геномные вирусы дают изумрудно-зелёное свечение.

Иммунофлюоресцентный  метод основан на соединении вирусов, внутриклеточных включений, скоплений вирусных антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченными флюорохромными красителями. Образовавшиеся комплексы дают свечение при люминесцентной микроскопии.

 

1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы  их получения    

       Культура клеток – клетки какой-либо ткани животных или человека,     способные расти и размножаться в искусственных условиях.

       Культуры клеток широко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин, незаменимы при проведении научных исследований в области вирусологии.

     Для успешного  получения клеточных культур  и последующего размножения в  них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения.

      Питательные  потребности клеток обеспечиваются  наличием незаменимых аминокислот  (таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови.

      Изотоничность  и буферность среды поддерживается  с помощью неорганических солей. Оптимальным является рН 7,2-7,4, при длительном культивировании клеток значение рН должно оставаться в пределах 6,8-7,8. Постоянство рН  в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО₂ (в противном случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону).

       Контроль  за реакцией среды осуществляется  путём добавления индикатора фенолрот: при рН 6,8-7,2 среда имеет жёлтый цвет, при рН 7,2-7,4 – оранжево-розовый, при рН 7,4-7,6 – красный, при рН 7,7-7,8 – красно-фиолетовый.

        Во время  приготовления клеточных культур  к солевым растворам и питательным  средам нередко добавляют антибиотики, чтобы избежать бактериального и грибкового загрязнения. Применяют пенициллин и стрептомицин (по 60 000 ЕД/мл), тетрациклины, доксициклин, другие антибиотики широкого спектра действия в концентрации 0,1-0,01 мг/л; противогрибковые антибиотики – нистатин (20 ЕД/мл) и фунгизон.

         Для приготовления  питательной среды требуется  вода высокой степени очистки,  так как культура клеток очень  чувствительна к ионам тяжёлых  металлов. Рекомендуется применять  бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах или очищенную в ионообменных колонках.

         Работу  с культурами клеток проводят  в тщательно обработанной «вирусологической»  посуде из специальных сортов  стекла или пластиковой посуде из полистерола для одноразового использования.

 

                                

                 Рис. 1. Лабораторная посуда для выращивания культур клеток

         Приготовленную  культуру клеток инкубируют в  термостате при температуре 36,0-38,5⁰С.

                                         1.2.1. Питательные среды

    Питательные среды для  клеточных культур в большинстве  случаев готовят на основе  солевых растворов, которые имеют состав солей, качественно и количественно приближающийся к составу жидкостей животного организма. 

                                                                                                        Таблица 1

                        Состав основных солевых растворов  (в г на л)                       

Вещества	Раствор  Хенкса	Раствор Эрла
NaCl	8,0	6,8
KCl	0,4	0,4
CaCl2	0,14	0,2
MgSO4×7H2O	0,1	0,1
MgSO4×6H2O	0,1	-
NaH2PO4×H2O	-	0,125
NaH2PO4×2H2O	0,06	-
KH2PO4	0,06	-
Глюкоза	1,0	1,0
Фенолрот (не всегда)	0,02	0,05
NaHCO3	0,35	2,2