Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

      Окончательная  идентификация выделенного вируса  проводится с помощью реакции нейтрализации с диагностическими вируснейтрализующими сыворотками. Определяют их родовую и видовую принадлежность.

            2.1.1. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток

      Основной  причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. Прекращается синтез РНК клетки-хозяина, что ведёт к подавлению синтеза белков, приводит к нарушению структуры клеточных мембран, лизосом, митохондрий. Освобождаются и активируются клеточные ферменты (лизосомальные), которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, т.е. развитие ЦПД. При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет.

      При  острой вирусной инфекции может  наблюдаться образование гигантских  многоядерных клеток – симпластов (или синцитиев). Симпластообразование  вызывают более 20 различных вирусов, имеющих ферменты: лецитиназу, нейраминидазу, и богатых липидами (напр., парамиксовирусы).

                            Рис. 5. Проявление ЦПД в культуре клеток 

      К проявлению ЦПД вирусов относится образование внутриклеточных включений. Они образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели. Образование включений может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

       С целью обнаружения вируса в материалах от больных проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур клеток. Для заражения отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Перед заражением из пробирок отсасывают культуральную жидкость, затем вносят по 0,1 мл исследуемого материала и добавляют питательную среду до 1 мл. Каждую пробу материала вносят в 4 пробирки. Для контроля несколько пробирок оставляют незаражёнными, но также сменяют в них питательную среду. Пробирки выдерживают в термостате, обычно при 37⁰С, и ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД (в течение недели и более).

       ЦПД  различных вирусов на клеточные  культуры обладает определённой  специфичностью. Родственные вирусы  дают цитопатическую реакцию сходного типа, эффект действия отдалённых по свойствам вирусов часто различен, поэтому по типу ЦПД можно судить о семействе или роде, к которым относится исследуемый вирус:

- энтеровирусы (вирусы  полиомиелита, Коксаки, ЕСНО) вызывают однородную мелкозернистую деструкцию клеток;

- аденовирусы превращают  клеточный слой в скопления  мелких, округлых клеток, расположенных  в виде гроздьев винограда;

- парагриппозные вирусы, респираторно-синцитиальный, вирусы  кори и паротита образуют симпласты.

      Количественное  определение вирусов в исследуемом  материале проводится с помощью  титрования. Для этой цели готовят  10-кратные последовательные разведения  вируса, которыми заражают клеточные  культуры. Титром вируса называют его наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине заражённых культур. Титр вируса выражают в цитопатических дозах (ЦПД₅₀) в 1 мл. За одну ЦПД₅₀ принимают 0,1 мл вируссодержащего материала, разведённого до титра.

      Для  идентификации выделенного вируса  по нейтрализации ЦПД культуральную жидкость смешивают с равным объёмом диагностической иммунной сыворотки (разведение сыворотки 1:5 или 1:10). После 1-2-часового контакта при комнатной температуре этой смесью (по 0,2 мл) заражают 4 пробирки с культурой клеток, из которой предварительно была удалена питательная среда; после добавления смеси в пробирки вносят по 0,8 мл свежей среды. Опыт сопровождается несколькими контролями:

1 – контроль незаражённой  культуры;

2 – контроль дозы  вируса – клеточные культуры  заражают той же дозой  вируса, что и в опыте;

3 – контроль культуры, заражённой смесью культуральной  жидкости с нормально сывороткой.

      Опыт  учитывают через 5-7 дней и более,  просматривая пробирки под малым  увеличением микроскопа. В первом  контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем – обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, сыворотка соответствует типу выделенного вируса.

                                          2.1.2. Реакция гемадсорбции

      Гемадсорбирующие  свойства имеют многие вирусы: орто- и парамиксовирусы, флавивирусы,  поксвирусы. Эти же вирусы обладают  спосодностью вызывать гемагглютинацию  – склеивание эритроцитов. Приобретение способности к гемадсорбции связано со встраиванием в мембрану заражённых вирусом клеток вирусспецифических белков – гемагглютининов, к которым эритроциты имеют комплементарные рецепторы и поэтому адсорбируются на поверхности заражённых клеток. В реакции применяют эритроциты морской свинки, кур, обезьян, человека 0 (I) группы. По наличию явления гемадсорбции обнаруживают присутствие вирусов в культурах клеток при латентной инфекции, когда цитопатический эффект оказывается слабо выраженным или отсутствует совершенно.

                                      Рис. 6. Реакция гемадсорбции

                      Техника постановки реакции гемадсорбции

    Предварительно  клеточные культуры заражают  исследуемым материалом. Реакцию гемадсорбции ставят каждые два дня до появления положительной реакции (в течение 8-10 дней). Для этого в пробирку с заражённой культурой вносят по 0,2 мл взвеси эритроцитов (0,4-1%) и выдерживают пробирки в наклонном положении, чтобы эритроциты соприкасались с клеточным слоем. Температура, при которой ставят опыт, и экспозиция зависит от вида вируса. Пробирки встряхивают и оставляют на некоторое время в вертикальном положении для оседания неадсорбировавшихся эритроцитов. При микроскопии под малом увеличением в опытной пробирке регистрируют положительную реакцию гемадсорбции, выражающуюся в том, что эритроциты адсорбируются на клетках культуры, прилипая к клеточному слою; в контрольной пробирке клеточный слой свободен от эритроцитов.

       При  добавлении специфической иммунной сыворотки в пробирку с клеточной культурой, предварительно заражённой соответствующим вирусом, заражённые клетки теряют способность адсорбировать эритроциты, т.е. происходит явление задержки гемадсорбции. Вследствие специфичности этого явления реакция задержки гемадсорбции может быть использована для идентификации выделенных вирусов, а также с целью обнаружения и титрования вируснейтрализующих антител в сыворотках больных.  

                                                  2.1.3. Метод бляшек

      Для  получения бляшек клеточный монослой  заражают небольшой концентрацией  вируса и фиксируют адсорбировавшиеся  на клетках вирионы с помощью  агарового покрытия, в которое  добавлен витальный краситель – нейтральный красный. ЦПД вирусов имеет очаговый характер, погибшие клетки дегенерируют, теряют способность удерживать нейтральный красный и обесцвечиваются. В результате на непрозрачном равномерно розовом фоне клеточного монослоя появляются бляшки в виде более прозрачных неокрашенных округлых пятен.

                                              Рис. 7. Метод бляшек

         Агаровое покрытие готовят из  высококачественного агара в  концентрации 1-1,5% и других компонентов  – солевых буферных растворов, дополнительных питательных веществ, антибиотиков. Раствор нейтрального красного входит в состав среды или его добавляют во флакон или чашку незадолго до учёта опыта. Часто вместо агара используют гель бентионита (5-6%) – это алюмосиликат природного происхождения, который биологически инертен и не токсичен для культур клеток.

              Обнаружение и титрование вирусов методом бляшек

       Для получения бляшек вирусов во флаконы или чашки наливают взвесь клеток в питательной среде (№ 199 или среда с гидролизатом лактальбумина). Флаконы закрывают резиновыми пробками, чашки заклеивают лейкопластырем и помещают в термостат на 5-6 дней для получения монослоя клеток, который должен быть сплошным, без признаков дегенерации. Перед заражением среду из флаконов или чашек удаляют и однослойную культуру клеток осторожно отмывают раствором Хенкса, который затем тщательно отсасывают. Заражение производят путём внесения разведённого исследуемого материала в объёме 0,1-0,25 мл и равномерного распределения этого материала по поверхности клеточного слоя с помощью покачивания. Через 30-60 минут заражённую культуру клеток заливают покровной средой. Флаконы или чашеи с застывшей средой помещают в термостат (клеточным слоем кверху) и выдерживают до образования бляшек (2-5 суток), после чего производят их подсчёт и изучение.

       Разные  вирусы образуют бляшки, отличающиеся  по величине, форме, характеру  краёв, по срокам появления  и другим свойствам, что может  быть использовано для предварительной  идентификации вируса.

      Для титрования вирусов готовят серийные разведения вируссодержащего материала и каждое из разведений вносят во флакон или чашку со слоем культуры клеток. Подсчитав образовавшиеся бляшки (с учётом разведения вируса), вычисляют титр вируса – количество вирионов в 1,0 мл исходного материала. Титр вируса, определяемый методом бляшек, принято выражать числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл.

       Метод  бляшек даёт возможность провести  точную идентификацию вируса  с помощью диагностических специфических  сывороток. При соответствии между сывороткой и вирусом происходит нейтрализация вируса и при заражении монослоя клеток  такой смесью бляшки не образуются или их количество значительно снижается.

                                             2.1.4. Цветная проба

      Цветная  проба (или цветная реакция)  основана на разнице в цвете  среды  индикатором фенолрот, в которой растёт нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, заражённая вирусом. В процессе  развития нормальной культуры  клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (рН 7,4 – 7,6), вследствие снижения рН до 7,0 – 6,8 приобретает жёлтый цвет.

       Заражение  культуры клеток вирусом приводит  к развитию в ней дегенеративных  процессов: происходит подавление  процессов метаболизма, значительно  понижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды остаётся на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остаётся красного цвета.

       С  помощью цветной реакции можно  определить соответствие вируса  и вируснейтрализующей сыворотки,  если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры.

        Цветную пробу ставят с различными  типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые культуры клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма. Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку.    

       При  работе с культурой почечных  клеток обезьяны готовят взвесь  клеток густотой 100-200 тыс. в 1 мл. Из неё делают ряд возрастающих  разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый н 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза – 25 тыс. клеток в объёме 0,25 мл.

                         Титрование вируса методом цветной пробы

      Цветную  пробу ставят в пробирках, которые  иногда закрывают резиновыми  пробками, но чаще разобщение  от атмосферного воздуха достигается  наслаиванием стерильного вазелинового масла (0,6-0,8 мл) или применение алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают в четыре пробирки.

      При  оценке результатов реакции учитывают  два тона: жёлтый и красный (табл. 3).

    При титровании  вируса по цветной пробе готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала. Эти разведения вируса, взятые в объёме 0,25 мл, смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объёме, добавляют питательную среду по 0,25 мл и наслаивают вазелиновое масло по 0,6-0,8 мл. В реакции ставят контроли клеточной взвеси: берут 1,1/2 и ¼ дозы клеток. Пробирки помещают на 5-6 дней в термостат при 37⁰С после чего по изменению цвета учитывают реакцию.

       Титром  вируса по цветной пробе называется  то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В данном примере (табл. 3) титр вируса равен 10^-4 (две пробирки красные, две – жёлтые). Количество вируса, содержащееся в объёме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой (ЦПД₅₀) вируса.