Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов

      За заражёнными животными (опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей. Учёт реакции проводят путём сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Определяют 50%-ную смертельную дозу – LD₅₀, проводя подсчёт по Риду и Менчу. Высчитывают индеек нейтрализации (ИН) по формуле, определяющей количество доз, нейтрализуемых сывороткой:

                   Титр вируса в опыте с нормальной сывороткой

        ИН = --------------------------------------------------------------------

                      Титр вируса в опыте с иммунной сывороткой

          ИН менее 10 – отрицательный;

          ИН – 11-49 – сомнительный;

         ИН равный 50 и выше – положительный.

     Заражённые  эмбрионы инкубируют при температуре  35-37⁰С от 48 до 72 ч. Затем яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают и в ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации. Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием, Конечный титр вируса в контроле и в опыте определяют путём статистической обработки.

                  Постановка реакции нейтрализации (II вариант)

       Реакцию ставят с различными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного живого вируса. Для этого к двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объёмы определённого разведения вируса (рекомендуется брать 100 или 1000 LD₅₀ вируса). Далее поступают как и в I варианте, то есть выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате, после чего вводят их мышам или куриным эмбрионам.

    При постановке  реакции нейтрализации на мышах  за титр изучаемой сыворотки  принимают разведение, дающее защитный  эффект у 50% мышей. В реакции  на куриных эмбрионах титром  сыворотки считается то наибольшее  её разведение, которое ещё способно  задержать гемагглютинирующее действие вирусов у 50% заражённых куриных эмбрионов.        

 

          2.3. Молекулярно-генетические методы исследования в диагностике   вирусных инфекций

       К  таким методам относятся молекулярная  гибридизация и полимеразная цепная реакция, которые позволяют обнаружить присутствие в исследуемом материале даже единичных копий генов определяемых вирусов (ДНК или РНК с определённой нуклеотидной последовательностью), и тем самым доказать наличие соответствующей инфекции.

             2.3.1. Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов)

      Метод основан на способности двухспиральной ДНК к денатурации и ренатурации. Денатурация – это расхождение цепей при нагревании ДНК до 80-100⁰С или обработке её щёлочью. Ренатурация – воссоединение цепей с помощью водородных связей при снижении температуры до 40-60⁰С (отжиг) и приобретение ДНК первоначальной двухспиральной структуры. Разъединённые цепи ДНК способны к гибридизации с фрагментами других односпиральных ДНК, имеющих комплементарные участки расположения нуклеотидов. К гибридизации комплементарных нитей способна также РНК, образуя комплексы ДНК – РНК или РНК – ДНК.

       Необходимые  для молекулярной гибридизации  фрагменты ДНК или РНК, с  помощью которых выявляют наличие  в исследуемом материале комплементарных нитей нуклеиновой кислоты, называются молекулярными зондами. Молекулярные зонды готовят из нуклеиновых кислот, выделенных из различных вирусов, иногда используют вирусную и-РНК, но чаще зондом служит клонированная рекомбинантная ДНК. Имеются наборы молекулярных зондов для определения многих вирусов.

        При постановке реакции молекулярной  гибридизации зонды метят радиоактивной  (Р₃₂), флюоресцентной или биотиновой меткой, соединяют с исследуемым материалом, содержащим определяемую нуклеиновую кислоту, подвергающуюся денатурации. Если зонд комплементарен цепи определяемой нуклеиновой кислоты, происходит гибридизация в комплементарном участке.

     После отжига  зонд оказывается включённым  в ренатурированную нуклеиновую  кислоту и может быть обнаружен по имеющейся метке. Выявление наступившей молекулярной гибридизации позволяет установить природу определяемого вируса. Чувствительность  этого метода составляет 10^-14 г/мл.

                     2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная

                            амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)

      ПЦР,  как и молекулярная гибридизация, основана на способности ДНК  к денатурации и ренатурации  и на комплементарности цепей  ДНК. Важным принципом реакции  является использование термостабильной ДНК-полимеразы, при участии которой происходит амплификация – умножение определяемых  генов или фрагментов с определённой нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован. Чувствительность этой реакции составляет 10^-18 г/мл.

    В реакции  участвуют следующие ингредиенты:

• определяемая ДНК вирусов в испытуемом биологическом материале, который предварительно концентрируется;
• праймеры 2-х типов (олигонуклеотиды) – короткие цепочки ДНК с нуклеотидной последовательностью комплементарной 3^,-концам каждой из двух цепей определяемой ДНК. Праймеры получают из нуклеиновых кислот различных вирусов, их нуклеотидную последовательность определяют методом секвенирования;
• свободные нуклеитиды (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты 4-х типов с различными азотистыми основаниями) – необходимый материал для осуществления амплификации;
• фермент термостабильная ДНК-полимераза – производит достройку комплементарных цепей ДНК из пула свободных нуклеотидов. Фермент выделяют из бактерий Thermus aquaticus или получают генно-инженерным методом.

       Сущность  ПЦР состоит в том, что определяемая  ДНК, находящаяся в тестируемом  биологическом материале, подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отжига присоединяются, вследствие их комплементарности, к 3^,-концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат «затравками» для последующей достройки цепей ДНК, осуществляемой термостабильной ДНК-полимеразой, которая использует для этой цели свободные нуклеотиды.

        В результате одного цикла  ПЦР количество молекул определяемой  ДНК удваивается, то есть происходит амплификация ДНК. Обычно проводят 25-40 повторных циклов амплификации и в итоге за 2-3 часа получают миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов.

        ПЦР проводят в 0,5-1,5 мл микроцентрифужных  пробирках в амплификаторах, которые  автоматически регулируют смену температуры. Каждому из 3-х этапов цикла амплификации – денатурации ДНК, отжига и достройки – необходима инкубация образцов при различном температурном режиме.

1. Денатурация – разъединение определяемой двухспиральной ДНК на две изолированные цепи при нагревании до 90-95⁰С в течение 0,5-1,0 мин.
2. Отжиг – восстановление двухцепочечной структуры определяемой ДНК в области присоединения комплементарного праймера – проводится при температуре 40-60⁰С 0,5 мин.
3. Удлинение (элонгация) – достройка каждой цепи определяемой ДНК доисходного двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК-полимеразы – проводится при температуре 70-75⁰С в течение 2-5 мин.

      Наличие  ДНК после повторных циклов  амплификации определяют с помощью  электрофореза в полиакриламидном геле, авторадиографией или другими методами.

      С помощью  ПЦР возможно определение не  только нуклеотидной последовательности  ДНК, но также РНК и, следовательно,  выявление РНК-вирусов (для этого  в реакцию вводят обратную  транскриптазу). ПЦР особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекции.

                          

                             Рис. 8. Схема полимеразной цепной реакции

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                   ЛИТЕРАТУРА

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. 3-е изд. – М.: Медицина, 1982.
2. Большой словарь медицинских терминов / Сост. Федотов В.Д. – М.: ЗАО Центрполиграф, 2007.
3. Вирусология. Методы / Под ред. Б. Мейхи. – М.: Мир, 1988.
4. Воробьёв А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология. – М.: АСАDEMA, 2003.
5. Голубев Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. – Л., 1986. Электронный учебник.
6. ПЦР «в реальном времени» / Под ред. Д.В. Ребрикова; 2-е изд., испр. И доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009.
7. Филдс Б., Найп Д. Вирусология. Т. 1-3. – М.: «Мир», 1989.
8. www. infections.ru/rus/all/mvb journals.shtml
9. www.blackwellmedstudent.com
10. www.medmaster.net

 

                                                  СОДЕРЖАНИЕ

 

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………….... 3

Раздел 1. Культивирование вирусов ……………………………………………4

1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований…………….4

  1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории…………………....4

   1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях…………….........5

   1.1.3. Обработка вируссодержащего материала………………………………5

   1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии…………….6

1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы  их получения………………..9 

   1.2.1.  Питательные среды…………………………………………………….11

   1.2.2. Типы клеточных культур………………………………………………12

1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах……...16

   1.3.1. Строение куриного эмбриона………………………………………….17

   1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку....18

   1.3.3. Заражение в аллантоисную полость……………………………...........20

   1.3.4. Заражение в полость амниона………………………………………….20

1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных…22

  1.4.1. Интраназальное заражение………………….……………………….....23

   1.4.2. Интрацеребральное заражение…………………………………............24

Контрольные вопросы………………………………………………………..….25

Тематика докладов……………………………………………………………….25

Литература………………………………………………………………………..25

Раздел 2. Индикация и идентификация вирусов………………………………26

2.1. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах..26

   2.1.1. Цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток…….......27

  2.1.2. Реакция гемадсорбции…………………………………………………29

   2.1.3. Метод бляшек…………………………………………………………..30

   2.1.4. Цветная проба…………………………………………………………..32

2.2. Применение реакции гемагглютинации (РГА), реакции

       торможения гемагглютинации (РТГА) и биологических

       моделей для индикации и идентификации вирусов……………………...35

   2.2.1. Техника постановки РГА………………………………………………36

   2.2.2. Техника постановки РТГА……………………………………………..37                           

   2.2.3. Реакция нейтрализации вирусов in vivo………………………………39

2.3. Молекулярно-генетические методы исследования

        в диагностике   вирусных инфекций……………………………………..41

    2.3.1. Молекулярная гибридизация (метод молекулярных зондов)………42

    2.3.2.   Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная

        амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК)……………………...........43

 Контрольные вопросы ………………………………………………………...45

Тематика докладов……………………………………………………………...46

 Литература ……………………………………………………………………..46