Наследственные болезни с нетрадиционным наследованием: болезни, обусловленные динамическими мутациями

Миодистрофия Ландузи-Дежерина как пример заболевания, обусловленного нарушением эпигенетической регуляции экспрессии генов

Лице-лопаточно-плечевая мышечная дистрофия Ландузи-Дежерина – третье по частоте наследственное заболевание мышц после миодистрофии Дюшенна и миотонической дистрофии. Его распространенность составляет примерно 2:100000 населения. Тип наследования – аутосомно-доминантный с пенетрантностью, составляющей около 95%. Мутантный локус FSHD1 расположен в дистальном конце длинного плеча хромосомы 4 в области 4q35-qter.

Довольно часто болезнь развивается вследствие возникновения мутации de novo. Примерно в половине этих случаев наблюдается соматический  мозаицизм либо у самих больных, либо у их бессимптомных родителей. Причем, среди больных мозаицизм чаще встречается у мужчин, чем у женщин, однако степень мозаицизма у больных женщин-мозаиков, как правило, оказывается выше, чем у больных мужчин- мозаиков. Риск рождения больных детей у соматических мозаиков, хотя и меньше, чем у гетерозиготных больных, но также повышен. При этом само заболевание у их больных потомков может протекать значительно тяжелее, то есть в этом случае может наблюдаться антиципация как по дебюту, так и по клиническим проявлениям болезни.

Первые признаки заболевания обычно появляются во второй декаде жизни, хотя возможен и более ранний дебют. Преимущественно поражается мускулатура лица, плечевого пояса и проксимальных отделов верхних конечностей. Характерной чертой является асимметричность поражения. Слабость мускулатуры лица проявляется неполным смыканием век, которое в начале болезни можно увидеть во время сна. Мимика лица становится бедной. Больной испытывает затруднения при наморщивании лба, зажмуривании глаз. Слабеет круговая мышца рта. Особый порядок вовлечения мускулатуры плечевого пояса приводит к формированию симптома «крыловидных» лопаток. Раньше других поражаются трапециевидные, ромбовидные и грудные мышцы. Спустя 15-20 лет после дебюта заболевания может развиться слабость мускулатуры тазового пояса и проксимальных отделов нижних конечностей. Течение заболевания относительно благоприятное. Больные в течение долгого времени сохраняют способность к самообслуживанию и трудовой деятельности.

В области 4q35 локализован макросателлитный тандемный высоко полиморфный повтор D4Z4. Каждая копия этого повтора размером в 3.3 кб содержит две гомеобоксные последовательности с внутренними стоп-кодонами и два известных повторяющихся элемента, часто вовлеченных в контроль «эффекта положения». В норме количество копий этого повтора варьирует от 11 до 100 элементов. D4Z4-повтор обладает высокой рекомбиногенностью, и у 3% населения наблюдается соматический  мозаицизм по реорганизациям этой области.

У больных лице-лопаточно-плечевой миодистрофией наблюдаются гетерозиготные делеции в области D4Z4-повтора, сокращающие число его копий до 1 - 10, причем размер этих делеций прямо коррелирует с тяжестью заболевания. Дистальнее D4Z4-повтора найден полиморфный сегмент размером около 10 кб, присутствующий в различных популяциях примерно в равном соотношении в двух состояниях, обозначаемых 4qA и 4qB. Однако у больных всегда обнаруживается только сегмент 4qA. Таким образом, сокращения D4Z4-повтора, происходящие на фоне 4qA-полиморфизма, и являются причиной развития заболевания. Это уникальный пример влияния полиморфного элемента, локализованного в  теломерной области хромосомы, на развитие наследственного заболевания. Интересно подчеркнуть, что в теломерной области длинного плеча хромосомы 10 (10q26) локализован гомологичный D4Z4-повтор, однако его сокращения не являются патогенными.

Область локализации D4Z4-повтора в хромосоме 4 у больных миодистрофией  Ландузи-Дежерина оказывается достоверно менее метилирована по сравнению с нормой. По-видимому, гипометилирование D4Z4 является одним из ключевых событий в каскаде эпигенетических нарушений, ведущих к развитию заболевания. Однако прямой зависимости между степенью гипометилирования D4Z4-области и характером течения заболевания не наблюдается.

ВD4Z4 найден элемент, специфически взаимодействующий с ДНК-связывающим мультибелковым комплексом. Этот комплекс опосредует транскрипционную репрессию генов, локализованных в области 4q35. По данным некоторых авторов в мышцах больных миодистрофией  Ландузи-Дежерина наблюдается гиперэкспрессия нескольких ближайших генов (FRG1, FRG2 и ANT), расположенных на расстоянии 100 кб и более от D4Z4-повтора. По-видимому, сокращенный D4Z4-повтор теряет способность взаимодействовать с мультибелковым комплексом, и это приводит к снижению его репрессорной функции по отношению к перечисленным выше генам. Однако результаты исследований экспрессии генов FRG1, FRG2 и ANT у больных носят противоречивый характер.

Так, при изучении экспрессионного профиля генов показано, что в мышцах больных достоверно изменен характер экспрессии генов, вовлеченных в миогенную дифференцировку. Многие из них являются прямыми мишенями транскрипционного фактора MYOD1, участвующего в развитии миофибрилл. Вторая группа генов, аномальная работа которых наблюдается в мышцах больных, связана с регуляцией реакции организма на оксидативный стресс. При этом значимых изменений в экспрессии генов, локализованных в непосредственной близости от цитогенетической области 4q35, не обнаружено, что находится в противоречии с выдвинутой ранее гипотезой о ведущей роли «эффекта положения» в этиологии заболевания.

Динамические мутации

Происхождение динамических мутаций представляет собой двухэтапный процесс. На первом этапе в результате редких мутационных событий происходит образование аллелей с «промежуточным» числом тринуклеотидных повторов, превышающим общепопуляционную норму, по не достигающим патологического порога. Такой аллель представляют собой «премутацию»: он не приводят к развитию болезни у данного и индивидуума, но характеризуется значительной генетической нестабильностью и повышенной вероятностью перехода в «полную мутацию» в последующих поколениях, что и приводит к манифестации болезни у потомков.

К настоящему времени известно уже более десятка наследственных заболеваний нервной системы, обусловленных динамическими мутациями. Наиболее обширную группу составляют заболевания с аутосомно-доминантным типом наследования (хорея Гентингтон, доминантные атаксии), обусловленные экспансией CAG-повторов в транслируемых областях соответствующих генов. Поскольку триплет С AG кодирует аминокислоту глутамин, такие мутации приводят к пропорциональному удлинению и изменению свойств белковых полиглутаминовых участков, в норме играющих важную роль в реализации сложных межмолекулярных взаимодействий.

Результатом мутации является формирование нерастворимых амилоидогенных белковых комплексов, ведущее к гибели специфических популяций нейронов. Предполагается, что в патогенезе указанной группы болезней важное значение имеет также нарушение взаимодействия мутантных нолиглутаминовых цепей с белками-регуляторами апоптоза, что может приводить к запуску процессов программируемой гибели нейронов. Экспансия  тринуклеотидных повторов может иметь место и в некодирующих областях генов - при атаксии Фридрейха, миотонической дистрофии, синдроме ломкой Х-хромосомы. В этих случаях мутации обусловливают нарушение нормальных механизмов транскрипции гена и угнетение белкового синтеза.

Открытие динамических мутаций, обусловленных увеличением числа тринуклеотидных повторов, показывает, что некоторые мутации изменяются при делении соматических или зародышевых клеток. Одни мутации летальны, и они не могут передаваться следующему поколению, а другие не столь опасны и сохраняются в потомстве.

Самые яркие примеры динамических мутаций - это увеличение числа тринуклеотидных повторов, которые вызывают синдром ломкой Х-хромосомы , атрофическую миотонию , болезнь Гентингтона , Х-сцепленную бульбоспинальную амиотрофию , спиноцеребеллярные дегенерации и другие заболевания.

В основе динамических мутаций лежит прогрессивное (динамическое) увеличение числа внутригенных повторов трех нуклеотидов (триплетов) GАG или GGG. Накопление таких повторов ведет к нарушению функции генов (синдром ломкой Х-хромосомы, отчасти синдром миотонической дистрофии) или к появлению необычного белкового продукта с длинной полиглутаминовой цепочкой, токсичного для определенного типа нервных клеток мозга (все - нейродегенеративные заболевания).

При синдроме  ломкой Х-хромосоме, в связи с наличием "динамического" типа мутаций наследование носит более сложный характер и может проявляться не только у мальчиков, у которых оно протекает особенно тяжело, но и у девочек, у которых болезнь может быть выражена в разной степени, т.е. имеет различную пенетрантность.

Краткая характеристика методов ДНК-диагностики

Методическую основу методов ДНК-диагностики, направленных на идентификацию мутаций или молекулярное маркирование мутантных хромосом, составляет полимеразная цепная реакция синтеза ДНК. Исторически более ранний метод блот-гибридизации по Саузерну используется до настоящего времени для идентификации некоторых мутаций, прежде всего "динамических мутаций", ведущих к болезням экспансии (синдром фрагильной Х-хромосомы, миопическая дистрофия, хорея Гентингтона, ряд нейродегенеративных заболеваний), а также гемофилии А и некоторых других заболеваний. Метод предложен Эдвардом Саузерном (Великобритания) в 1975 г. Суть метода заключается в том, что геномная ДНК подвергается рестрикции одной или несколькими рестриктазами, после чего образующиеся фрагменты разделяются по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном геле. Затем ДНК подвергается денатурации и переносится с геля на плотный носитель (обычно - нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам перенос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченным ДНК- или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

Метод ПЦР предложен в 1983 г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г.

Метод ПЦР, или специфической амплификации ДНК, позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигонуклеотидными последовательностями ДНК, длиной обычно от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК соответственно. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул.

Разработаны и широко используются в практике различные варианты данного метода, позволяющие быстро и эффективно идентифицировать мутации, изучать ДНК-полиморфизмы, применяемые для молекулярного маркирования мутантных хромосом. Методы идентификации уже известных мутаций в исследуемом гене, основанные на принципе ПЦР, включают:

метод аллель-специфических олигонуклеотидов (АS0);

метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза;

метод амплификации рефрактерной мутационной системы (АRМS);

метод гетеро-дуплексного анализа

Прямая и косвенная ДНК-диагностика

Решающим преимуществом методов ДНК-диагностики является их универсальность, т.е. они могут быть использованы практически на любой стадии развития организма и практически на любых тканях. В диагностике генных болезней существуют два основных подхода - прямая диагностика, основанная на непосредственной идентификации мутации в определенном гене и непрямая (косвенная) диагностика, в основе которой лежит маркирование мутантного гена (иногда называемая маркированием хромосомы, несущей мутантный ген) с помощью молекулярных маркеров.

Основу прямой диагностики доставляет идентификация мутаций в самом гене.

Преимущества метода: 1) высокая (приближающаяся к 100%) точность диагностики; 2) возможность анализа информативности (пригодности для молекулярной диагностики)семьи и выявление гетерозиготных носителей при отсутствии больного ребенка.

Недостаток метода - отсутствие сведений о мажорных мутациях гена, требующее зачастую достаточно детального молекулярного сканирования его первичной структуры с целью обнаружения мутаций. Алгоритмы молекулярной диагностики различных моногенных болезней приведены выше и в монографии.

Непрямой (косвенный) подход в молекулярной диагностике является исторически более ранним и более универсальным. Его концептуальную основу составляет маркирование мутантного гена (хромосомы) при помощи молекулярных маркеров. В качестве последних обычно выступают полиморфные сайты, т.е. короткие ДНК-последовательности одних и тех же участков гомологичных хромосом, отличающиеся по своей первичной структуре. Эти диагностические полиморфные сайты могут располагаться либо внутри самого гена, либо находиться в непосредственной близости от него. В самом простом варианте - это замена единичного нуклеотида, делающая данный фрагмент ДНК устойчивым или, наоборот, чувствительным к определенной рестриктазе (эндонуклеазе) - ферменту микробного происхождения, узнающему определенную последовательность из четырех и более нуклеотидов и разрезающему (рестрицирующему) молекулу ДНК .

Наличие или отсутствие сайта рестрикции в тождественных локусах гомологичных хромосом позволяет достаточно надежно маркировать мутантный и нормальный ген и проследить его передачу потомству.

Другой тип ДНК-полиморфизма представлен короткими тандемными ди-, три-, тетра- и более повторами также расположенными внутри или рядом с геном, длина которых варьирует на разных гомологичных хромосомах.