Фармацевтикалық және медициналық өнеркәсіптеріндегі биотехнология

          Гомогенді - үздіксіз процесте ферментерде периодтық әдіспен өсірілген культураның өсу қисығының кез келген нүктесіне сәйкес қолайлы жағдай тууы мүмкін. Бұл жағдайда бекітілген режимде  культивирлеу үлкен диапозондағы  субстрат концентрациясын араластыру жылдамдығы іс - жүзінде нолге тең. Бұл аралық екі маңызды және араластыру жылдамдығымен анықталады.

 Біріншісі–араластыру  жылдамдығының критикасы D_кр, ол меншікті өсу жылдамдығының максимумынан да үлкен болады. D_кр > μ_макс . Мұндай жағдайда микроорганизмдер өсуіне қарағанда, жуылуы тез жүреді және олардың концентрациясы біртіндеп нолге дейін төмендейді, ал субстрат концентрациясы (лимиттелген факторға ) максимум мәніне дейін жетеді.

 Екіншісі –   араластырудың  шектелген жылдамдығы - көлемі  өте төмен. Ағымның  жылдамдығы осы мәнге жеткенше беріледі де, ал  жасушалар ферментерде жиналып, стационарлы өсу фазасына  ауысады.

 

Хемостатты культивирлеу

 Гомогенді - үздіксіз  культивирлеуде культураның шегіне  дейін өсуі шектелмеген қалған элементтің саны  қоректену элементі арқылы қамтамасыз етілген болса, мұндай үздіксіз культивирлеуді хемостатты деп аталады.

Олай болса,  микроорганизмдердің  өсуін  ортаның химиялық факторлары реттейді .

Хемостатты культура  болып биомасса суспензиясын толық  араластыруды, оған тұрақты жылдамдықпен ортаның берілуін және сол жылдамдықпен культуралды сұйықтық жасушамен бірге шығарылуы саналады. Ортаның компоненті мынадай жолмен бөлініп алынады,  қоректенудің  бір элементі жеткіліксіз түрде болуымен, сонда популяция тығыздығын оның концентрациясы арқылы анықтауға болады. Қалған қоректік элементтер артығымен беріледі, ол культивирлеу жағдайын ( t, рН, аэрация ) оптимальды ұстап тұрады. Хемостатта араластыру жылдамдығы алдын ала беріледі және лимиттелген компоненттер концентрациясы бақыланады. Микроорганизм осыған байланысты өздерін өз концентрациясымен ұстап тұрады. Хемостатты культивирлеу берілген қажетілікпен араластыру D коэффициентімен бұл вариантта гомогенді ағымда культивирлеу, оған культураның өсу жылдамдығы µ тұрғызылған.

Бұл кезде әр түрлі факторлар берілген шектелген концентрацияда биомассаның өсуіне қоректенетін компонетімен жағдай жасалғаны анықталған. Төмен субстрат қоректенбегенде (демек лимитация) күшті болады, жоғарыда - әлсіз. Бұл культивирлеу әдісі лабораториялық жағдайда кеңінен қолданылады, ал өндірісте  белгілі осы факторда өсуін шектейді.

Хемостатты культивирлеудің теориясы.

Биомасса концентрациясымен  Х, субстрат S және өсу жылдамдығының  арасында қатынастар пайда болады.

Культураның өсуін хемостаты  қисық сипаттайды. Аэробты жағдайда D араластыру жылдамдығы.

1 – биомасса концентрациясы, Х

2 – қалдық субстраттың  концентрациясы, S

 

мұндағы: µ - бірлік уақыттағы биомасса өскендегі өсудің меншікті жылдамдығы.

мұндағы:  F – ағымның  жылдамдығы, 

                 V – культураның көлемі.

      

Ортадағы бар элементтің ауыстыру уақытысында немесе ортаның әр элементінің ферментерге  келу уақытысы.

X – биомассаның балансы,  кіріс, шығыс, демек биомассаның  санының өзгеруі ағып өтетін биомассаның - өсуі.

Өсу жылдамдығы    

Субстаттың  лимитеуші өсуінің  балансы 

Санының өзгеруі –  ағымы микроорганизмнің субстратты тұтынғандағы – әкелетіні.

Субстраты тұтыну жылдамдығы тең:

;

мұндағы: γ – экономикалық коэффициент немесе тұтынатын субстраттың синтезіндегі өткен доля биомассасы;

S_r – ортаға түсетін субстраттың концентрациясы;

S – ферментердегі субстраттың концентрациясы.

Ферментердегі стационарлы  жағдайы:

мұндағы: µ_m – max – өсудің мүмкіншілік жылдамдығы;

K_S – const моно/қанықан const лимитеуші субстратың қалдық концеңтраты,  жәймен өсуідің шектейді.

S=K_S·D/( µ_m - D)

D= µ_m - ферментерден биомассаны шығарғанда теория жүзінде араластырғандағы критикалық жылдамдығы.

Іс жүзінде  D_кр =

Биомасса алуадағы ферментердің өнімділігі: R=D_x

Негізгі константын біліп  және Y, µ=α мәні қандай болса да, культураның параметрін Х және S есептеуге болады.

Хемостаты әдіс көп вариантқа  ие.

Бір сатылы – max-дан басқа  культураның жылдамдығының барлығының қажет болғанын  жасайды.

Екі сатылы – екі тізбектелген ферментерде культураның max өсу жылдамдығын бақылау және оны жоғарылауы үшін жағдай жасау.

 

Осы үшін бірінші ферментерде культивирлеу D>µ_m кезде жүреді, демек, ал екіншісінде біріншіден ферментерден культура беріледі және жаңадан жасалған орта беріледі. Екінші ферментерде ағымның жоғары жылдамдығы жүреді,бірінші ферментерден үздіксіз культура келіп түседі.

 

Аппаратура

Хемостаты әдіс күрделі  құрал – жабдықты қажет етеді: 0,5-2л сиымдылықтағы ферментер немесе термостатандырылған  аэрация араластырумен және белгілі жылдамдықпен ауа беру , автоматты түрде берілген деңгейін ұстау үшін оттегімен қаныққан ортаны өлшейтін электрод ортаны беруге мөлшерлеуші насостар. Датчиктің көрсеткіші, рН және О₂ мәнінің көрсеткішін автоматты өзі жазаылатынмен тіркейді.

 

Жұмыстың орындау әдісі

Жұмыс үш тапсырмадан  тұрады. Микроорганизмдердің дамуына сыртқы жағдайдың әсерін зерттеу.

 

1 тапсырма. Микроорганизмнің дамуына ылғалдың әсері

 

Материалдар және құрал – жабдықтар 

 

Ақ нанның бір жапырақ  бөлігі, Петри табақшасы, микробиологиялық ілмешек, зең саңырауқұлақтың таза культурасы, спировка, 0,5л шыны банка қақпағымен, топырақ, заттың әйнек, фильтр қағазы.

 

Жұмыстың орындалуы 

 

Нанның бірнеше түйірін  алып әр түрлі ылғалдылықта Петри  табақшасына салады және 20 минут 1атм-да зарарсыздайды.

Нанның бетіне зең саңырауқұлақтың спорасын жағады. Табақшаны термостатқа 25°С температураға қояды. Нанның бетінде өскен саңырауқұлақ колониясын күнде өлшейді. Әр түрлі ылғалдылықта жиналған микроорганизмнің өсу қисығын тұрғызады. Екінші этап ұзақ уазытты қажет етеді. 0,5 л шыны банкаға ауада кептірілген топырақты 10 см қалыңдықта салады. Топырақты толығымен әр түрлі деңгейде ылғалдайды, банканы қақпақпен жабады. Заттық әйнекті фильтр қағазбен орап банкаға салады және 5-7 см қалыңдықта топырақпен жабады да жылы жерге бір айға қалдырады. Осы уақыт аралығында периодты түрде ылғалдылығын тапсырма бойынша қадағалап отырады. 1,2,3 ай өткесін фильтр қағаздың жағадйын банкадағы қадағалайды. Жасушаны ыдырататын бактерияның дамуына топырақтың ылғалдылығының әсеріне қорытынды жасайды, Әр түрлі топырақтың ылғалдылығы топырақтың массасына қатынасына қарап белгілі судың мөлшеріне құяды. Әрмен қарай банкада тұрақты масса болуын суды оған мөлшерлеп құюмен ұстайды.

 

2 тапсырма. Бактерияның дамуына жарықтың әсері

 

Материалдар және құрал – жабдықтар және

ЕПА бар Петри табақшасы, ішек таяқшасы бар таза кульура, микроиологиялық ілмешек, спиртовка, қара қағаз, қайшы, желім, шыны штапел, зарарсызданған 1 мл суы бар пробирка, зарарсызданған пипетка.

 

 Жұмыстың  орындалуы 

      Суытылған ЕПА бетіне ішек таяқшасының таза культурасын мол етіп құйылады. Ол үшін культурадан бактерияны ілмешекпен алады, және пробиркада 1мл зарарсызданған сумен (разводка) араластыру жасайды. Қоректік ортаның бетіне араластырылған культураның бірнеше тамшысын зарарсызданған пипеткамен жүргізеді және шыны штапельмен бетіне жағады. Петри табақшаның түбіне кішкене саңылау жасалған жеріне қара қағазды желімдейді. Петри табақшасын бірнеше сағатқа күн көзіне қояды, олай жасайтын себебі ортаның барлығы емес, тек бір бөлігін ғана қара қағаздың астындағы терезенің астын ғана күн сәулесі түсу үшін. Табақша шағылыстырылғаннан кейін термостатқа 43°С температураға қояды. Келесі сабақта табақшаны қарап анықтап және ортада жарықтандырғанға ұшырайтын бактерияның өскені табылады.

 

3 тапсырма. Бактерияның өсуіне температураның әсері

 

Материалдар және құрал – жабдықтар

ЕПА бар Петри табақшасы, 1мл суы бар зарарсызданған пробирка, картоп және пішен таяқшасы, микробиологиялық ілмешек, спиртовка, шыны шпатель, пипетка, термостаттар.

 

   Жұмыстың  орындалуы 

       Картоп  және пішен таяқшасымен  микробиологиялық ілмешекпен, 1мл суы бар зарарсызданған пробиркаға ауыстырады,мұқият араластырады.Содан соң пипеткамен бактерияның араластырылған массасын  пипеткамен алып және  ЕПА бетіне екі тамшыдан  жүргізеді. Шыны шпателмен агардың бетіне материалды жүргізеді.Петри табақшасын термостатқа 20,40,60⁰С температурада қояды және тоңазытқышқа 4⁰С температураға  қояды.Келесі сабаққа алынған нәтижелерді қадағалап,  берілген бактерияның өсуі үшін оптимальды температурасын таңдайды.

 

Бақылау сұрақтары:

1. Микроорганизмдерді культивирлеуге түсінік.

2. Периодты культивирлеу.

3. Үздіксіз культивирлеу.Хемостаты  культивирлеу.

4. Культивирлеуге арналған  аппаратуралар.

 

5. Микроорганизмнің сандық  сипаттамасы.

6. Микроорганизмді культивирлеуде  аэрация.

7. Микроорганизмді культивирлеуге сыртқы процестің әсері.

 

№6  зертханалық  жұмыс

 

Ішек микрофлорасын  тұрақтандыру препаратын алу (2 сағат)

 

Жұмыстың мақсаты: адам организмінің   қалыпты микрофлорасы, оның бұзылу себептері туралы негізгі түсініктерімен, дисбактериоздың пайда болуын, қоректік орталарды дайындау әдісін меңгеру және лактобактерияны, бифидобактерияны, ішек таяқшасын қультивирлеу

 

Теориялық негіздері

Адамның организмі және оны қоршаған орта экологиялық жүйе болып табылады, онда ең үлкен физиологиялық рөлі адамның микробтары - симбионттары жатады. Көптеген сыртқы факторлардың құрамымен салыстырғанда тұрақты болып келетін микрофлораға әсер етеді. Олардың әсерімен, әсіресе антибиотиктерді, химиятерапиялық дәрілерді қолданған кезде, ауыз қуысының, терінің және ішек микрофлорасының құрамының бұзылуы мүмкін. Нәтижесінде ішек дисбактериозды (стафилококкты, протейді, кандидозды және тағы басқа) микроорганимздердің қалыпты микрофлорасының бұзылуына әкелетін қауіпті ауруларды болдырады.Қалыпты микрофлораның құрамындағы өзгерістермен байланысқан аурудың дамуының негізгі себебі, организмнің иммунологиялық гомеостазасының механизмдерінің бұзылуынан құралады. Сонымен қатар, дисбактериоз кезіндегі ішекте орналасқан антибиотикті-резистентті микроорганизмдер (ішек таяқшалары, стафилококктар, Candida тұқымдас ашытқылар және тағы басқа) қалыпты микрофлорадан зат алмасуы бойынша ерекшеленеді және қалыпты микрофлораға тән көптеген маңызды функцияларды атқара алмайды.

Ішек микрофлорасындағы  кең таралған өзгерістермен байланысты және дисбактериоздың патологиялық жағдайларымен байланысты  белгілі бір аурулар тобы пайда болады, оларда жалпы қабылданған дәрілік препараттар қалыпты микрофлораны қалпына келтіре алмайды. Бұл жағдайларда  қалыпты ішек микрофлорасының тірі микробтарынан алынған  препараттарды қолдану әдісі комплексті емдік дәрілер бактериотерапия үлкен маңызды рөл атқарады.

 

Жұмысты орындау  әдісі

 

Жұмыс оқытушының тапсырмасы бойынша бірнеше вариантпен

орындалады

1 Вариант. Колибактерин өндірісі үшін ішек таяқшасын культивирлеу. Құрғақ колибактерин ампулаларға, флакондарға буып түйілген немесе таблеткаланған, ішек таяқшасының М-17 штаммының лиофилизденген тірі

 

культурасы болып табылады. Колибактеринді пайдаланудың жағымсыз жақтары жоқ.

Материалдар және құрал-жабдықтар: лиофилизденген тірі Е.Соlі культурасы, 100 мл, 500 мл колбалар, пробиркалар, культивирлеуге арналған сілкігіш қондырғы, заттық және жабын әйнектер, фуксин, микробиологиялық ілмешектер, спиртовка, желатин, жаңадан жасалған ет-пептонды сорпа, казеин немесе сүт.

 

Жұмыстың орындалуы

Анабиоз күйінен қалпына  келтіру үшін М-17 штаммының Е.Соlі  лиофилизденген культурасының 0,1г зарарсызданған жағдайда 50 мл салады.Ортаның құрамы :

1 Орта       2 Орта

Зарарсызданған сүт -98%            Ет-пептонды сорпа - 98%

Желатин - 2 %     Желатин - 2%

рН - 7,2   ÷8              рН - 7,2  ÷8

 

6-7 сағат бойы термостатта  37°С температурада 100 мл-лік   колбада мақта тығынмен жабылған колбаларда инкубирлейді.Содан соң бактерия суспензиясын құрамында 300 мл 1  немесе 2 ортасы бар 500 мл-лік зарарсызданған колбаларға қайта ауыстырады және 37°С температурада 6-10 сағат бойы сілкігіште  араластырады және аэрациялау жағдайында инкубациялайды. Культивирлеу аяқталғаннан кейін жұғынды дайындалады, оны фуксинмен бояйды және микроскоптың астында Е.Соlі жасушаларының санын есептейді. Алынған суспензияның құрамында 1 мл-де 35-40 млрд.тірі бактериялар болу керек.

Қосымша ақпарат. 1.Өндірістік жағдайларда дайын препаратгы алу үшін бактерия суспензиясына 10 % сахарозаны қосады, лиофилизациялауды жоғарғы вакуумды(5·10^-3 мм.сын.бағ. дейін) сублимациялы камерада жүргізеді және соңғы өнімнің қалдықтық ьшғалдылығы 2 ÷4 % болады.

Таблеткалау үшін құрғақ жартылай фабрикатқа лактозаның (2%), медициналық тальктің (2 % дейін),кальций немесе магний стератын (1 % дейін) қосады.