Получение этанола. Определение содержания редуцирующих веществ (РВ) в сусле, последрожжевой и спиртовой бражке эбулиостатическим методом.

Цель  работы: проведение процесса спиртового брожения углеводсодержащих субстратов, изучение закономерностей процесса, вывод реального уравнения брожения, определение выхода этанола, составление углеродного и углеводородного баланса процесса. Определение содержания редуцирующих веществ ( РВ ) в нейтрализате, сусле, барде, последрожжевой и спиртовой бражке эбулиостатическим методом.

Теоретическая часть.

 

Процесс получения  этанола - спиртовое брожение. Спиртовое брожение – это процесс превращения углеводов под действием микроорганизмов в этанол и диоксид углерода с выделением энергии, необходимой для протекания биохимических реакций. Спиртовое брожение – анаэробный процесс. Основными продуцентами этанола являются дрожжи рода Saccharomyces и Schizosaccharomyces. В результате спиртового брожения молекула гексозных моносахаридов превращается в 2 молекулы этанола и 2 молекулы диоксида углерода с выделением 235 кДж энергии на 1 моль глюкозы.

 

С₆H₁₂O₆=2C₂H₅OH+2CO₂+235 кДж/моль.

 

В результате реакции  образуется большое число побочных продуктов: альдегидов и эфиров, метанола, высших спиртов, органических кислот и т.д.

Теоретический выход этанола составляет 51,1 % по массе от исходных моносахаридов  или 64,0 объемных процента, следует отметить, что дрожжи родов Saccharomyces и Schizosaccharomyces сбраживают только гексозные моносахариды.

Наряду с  энергетическими процессами образования  этанола при брожении протекают  и конструктивные процессы образования  биомассы микроорганизмов, приводящие к снижению выхода этанола.

В качестве субстратов для получения этанола используют крахмалосодержащее сырье, гидролизаты растительного сырья, сульфитные щелока, мелассу, а в лабораторных условиях синтетические среды.

Эбулиостатический метод основан на реакции окисления  редуцирующих веществ медно – щелочным раствором в присутствии индикатора метиленовой сини без доступа кислорода воздуха.

Раствор изменяет окраску от синей до бесцветной, т.к. метиленовая синь в окислительной  среде имеет синюю окраску, а  в восстановленной среде она  бесцветна.

Для растворения образовавшейся в процессе реакции закиси меди применяют желтую кровяную соль.

В эбулиостатическом  методе используют принцип прямого  или обратного титрования. Прямое титрование проводят при анализе  светлых растворов и растворов, содержащих более 0,05 % редуцирующих веществ, обратное – при анализе окрашенных растворов, а также растворов с содержанием редуцирующих веществ менее 0,05 %.

 

Оборудование.

 

Рис.1. Прибор для  определения редуцирующих веществ:

1-Термостойкая  коническая колба, 2- эбулиостат, 3- внутренняя трубка, 4- стеклянная изогнутая трубка, 5- бюретка.

 

Приборы для  определения редуцирующих веществ  состоит из внешнего сосуда (термостойкая коническая колба) и эбулиостата (внутренний сосуд). Эбулиостат представляет собой  пробирку суженную кверху и имеющую внутри трубку. Один конец трубки впаян в верхнюю часть боковой стенки эбулиостата, второй ее конец остается свободным и доходит почти до дна сосуда. Эбулиостат соединен с внешним сосудом с помощью резиновой пробки, в которую кроме эбулиостата вставлена стеклянная изогнутая трубка. На конец стеклянной трубки надета резиновая трубка с винтовым зажимом для регулирования выходящего из сосуда пара.

К эбулиостату  подсоединяют бюретку с помощью  резиновой пробки, которая не должна закрывать боковое отверстие горловины эбулиостата во избежание затруднения выхода избыточного пара.

Рис.2. Автоклав:

1 —  крышка; 2 — резиновая прокладка; 3 — отверстия для поступления пара; 4 — водопаровая камера; 5 — металлический кожух; 6 — стерилизационная камера; 7 — слой асбеста; 8 и 14 — спускные краны; 9 — подставка; 10 и 12 — краны для заправки воды; 11 — водоуказательное стекло; 13 — манометр; 15 — предохранительный клапан.

 

 

Рис. 3. Обратный холодильник

 

Рис. 4. Затвор ртутный

 

Ход работы.

 

1. Приготовление реактивов:

 

а) раствор первый: сернокислую медь (CuSO₄∙5H₂O) массой 5 г и метиленовую синь массой 0,02 г, взвешенные с погрешностью 0,0002 г, с помощью дистиллированной воды (около 800см³) количественно переносим в мерную колбу вместимостью 1 дм³. Раствор тщательно перемешиваем до полного растворения солей, затем объем раствора доводим до метки дистиллированной водой и вновь перемешиваем.

б) раствор второй: калий-натрий виннокислый массой 25 г помещаем в стакан и растворяем в 200-300 см³ дистиллированной воды. Желтую кровяную соль массой 2 г помещаем в другой стакан с 100 см³ дистиллированной воды и перемешиваем до растворения. Оба раствора переносим в мерную колбу вместимостью 1 дм³, туда же вливаем 50%-ый раствор гидрата окиси натрия (масса NaOH=3,75 г) и объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. Раствор перемешиваем и храним в склянке из темного стекла.

в) 250 мл раствора глюкозы, концентрации 1,5 %: на аналитических весах в стакан для взвешивания отвешиваем глюкозу массой 3,75 г с погрешностью ±0,0002 г. Предварительно в стакан наливаем около 5 см³ дистиллированной воды для устранения распыления глюкозы при растворении ее в воде. Из стакана глюкозу количественно переносим в мерную колбу вместимостью 250 см³ и объем раствора доводим до метки водопроводной водой.

 

2. Подготовка субстрата:

 

К 250 мл подготовленного водного раствора глюкозы с концентрацией РВ 1,5% добавляем питательные соли в виде раствора аммофоса из расчета 1 мл на 1г РВ(3,75 г). Подготовленное сусло разливаем в 2 колбы (объем сусла в каждой колбе 100 мл), закрываем ватно-марлевой пробкой, заворачиваем пробку бумагой и стерилизуют в автоклаве насыщенным водяным паром при температуре 120°С и избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. В сусле определяем точную концентрацию РВ эбулиостатическим методом. После стерилизации сусло охлаждаем до комнатной температуры, вносим в него прессованные засевные дрожжи Saccharomyces cerevisiae в количестве 10...30°/о от массы РВ, колбу закрываем гидрозатвором и взвешиваем на технических весах с точностью до 0,01г. Спиртовое брожение проводим в термостате при температуре 32°С в течение 72 ч до остаточной концентрации РВ 0,1%.

В отдельной пробе определяем коэффициент сухости засевных дрожжей весовым способом.

 

3. Определение титра Фелинга при приготовлении 0,1% глюкозы. Определение концентраций РВ(исходной и остаточной). Фильтрование растворов:

 

В сосуд наливаем воду и ставим на нагревательный прибор. Для равномерного кипения воды на дно сосуда помещаем кусочки разбитого стеклянного пористого фильтра или шамотного кирпича.

Затем в сосуд вставляем  пустой эбулиостат для прогревания.

Бюретку промываем 2-3 раза исследуемой  пробой и затем заполняем ее таким образом, чтобы в бюретке не оставалось пузырьков воздуха.

После закипания воды в сосуде, эбулиостат заполняем медно-щелочным раствором. К эбулиостату присоединяем бюретку, заполняем пробой. После закипания медно-щелочного раствора начинаем приливать пробу из бюретки со скоростью 3-4 капли в секунду, не допуская прекращения кипения раствора в эбулиостате. Количество приливаемой пробы должно составлять 80-90 % от общего объема, расходуемого на титрование. Если концентрация РВ в растворе неизвестна, то проводим ориентировочное титрование с целью установления общего расхода исследуемой пробы. После введения в эбулиостат пробы продолжаем его кипячение в течении 2 мин, замеряя время по песочным часам. По истечении этого времени возобновляем приливание пробы из бюретки со скоростью 1 капля в 6-7 сек. Титрование заканчиваем при появлении желтого окрашивания медно-щелочного раствора и отмечаем объем исследуемой пробы, израсходованный на титрование.

 

4. Анализ спиртовой бражки

 

После окончания  брожения колбы вынимают из термостата, охлаждают до температуры окружающей среды и взвешивают на технических  весах для определения количества образовавшегося СО₂, массу которого определяют по разности масс колбы до и после брожения:

 

Мсо₂ = т₁- т₂,

 

где т₁ - масса бродильного сосуда до брожения, г; т₂- масса бродильного сосуда после брожения, г.

Биомассу дрожжей  отфильтровывают на бумажном фильтре, промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции рН 7,0 с известной массой и сушат до постоянной массы в термостате при температуре 105°С. По разности масс абсолютно-сухих дрожжей после брожения и до брожения определяют прирост биомассы:

 

Δ т_б= т_а.с.д.- т_а.с.з.д.,

 

где т_а.с.д. - масса абсолютно-сухих дрожжей после брожения; т_а.с.з.д. - масса абсолютно-сухик засевных дрожжей;

 

т_{а.с.з.д.=} т_з.д.∙ к,

 

здесь т_з.д. - масса прессованных засевных дрожжей; к - коэффициент сухости засевных дрожжей.

В бражке определяют величину рН, остаточное содержание РВ (эбулиостатическим методом) и концентрацию этанола (флотационным способом).

Флотационный  метод определения спирта в бражке и барде основан на зависимости  между плотностью раствора этанола, его концентрацией и температурой. Флотационный метод основан на применении поплавка, который приходит в состояние зависания при погружении в жидкость с плотностью, равной плотности поплавка при данной температуре. Состояние флотации характеризуется тем, что поплавок не тонет и не всплывает, а может оставаться неподвижным на любом уровне внутри жидкости. В растворах низкой концентрации выравнивание плотностей раствора этанола и поплавка производят путем нагревания или охлаждения раствора. Чем больше концентрация этанола, тем ниже будет температура зависания поплавка; с уменьшением концентрации температура зависания будет выше. Флотационный метод позволяет определять концентрацию этанола с точностью до 0,01°/о при определении температуры с точностью до 0,1°С.

С помощью пипетки  отмеряют 50 мл исследуемого раствора и  переносят его в колбу перегонной установки емкостью 100 мл. В колбу вносят 2...3 стеклянных шарика для обеспечения равномерного кипения. Для связывания летучих кислот добавляют 1 мл 10%-го раствора NаОН и устанавливают на колбу брызгоуловитель Кьельдаля, к которому подключают водяной холодильник Либиха с форштосом. Дистиллят собирают в мерную приемную колбу объемом 25 мл. Включают электроплитку и отгоняют этанол со скоростью 2,5 мл/мин. Перегонку заканчивают, когда в приемнике наберется около 24 мл отгона, затем доводят объем водно-спиртового раствора дистиллированной водой до метки, перемешивают и определяют температуру зависания выбранного поплавка. Стаканчик с исследуемым раствором закрепляют в штативе, в раствор погружают термометр и опускают один из поплавков, входящих в набор поплавков в количестве 6 штук, имеющих плотности, соответствующие плотности воды при 20, 26, 30, 33, 35 и 38°С. Поплавок представляет собой пустотелый стеклянный шарик диаметром 10 мм с определенным номером. К каждому поплавку прилагается паспорт с таблицей для определения концентрации этанола по температуре зависания поплавка.

Для определения  используют тот поплавок, который  должен зависнуть в исследуемом  растворе при температуре, близкой  к температуре окружающей среды, а температура ночки зависания не должна отличаться от нее не более чем на 3°С.

Если поплавок тонет, т.е. его плотность больше плотности раствора, то путем охлаждения раствора холодной водой достигают состояния зависания поплавка. Если поплавок всплывает, то плотность жидкости понижают нагреванием. Во время нагревания или охлаждения раствора производят перемешивание его мешалкой. По температуре зависания и таблицам находят концентрацию этанола. Для определения истинной концентрации этанола в бражке найденную величину делят на 2 и умножают на поправочный коэффициент 1,03:

 

 

Концентрацию  СО₂, %, определяют по формуле

 

 

 

 

 

Концентрация  прироста биомассы, %:

Выход этанола  от утилизированной глюкозы, %

где, - концентрация этанола в спиртовой бражке, % ; - концентрация РВ в субстрате, %; - концентрация РВ в спиртовой бражке, %.

Выход этанола  от теоретически возможного, %:

где -в.ыход этанола от утилизированной глюкозы, %; 51,1 – теоретический выход этанола из гексозных моносахаридов.

Выход СО₂ от утилизированной глюкозы, %:

где - концентрация СО₂, %; - концентрация РВ в субстрате, %; - концентрация РВ в спиртовой бражке, %.

Выход СО₂ от теоретически возможного, %:

где -выход СО₂ от утилизированной глюкозы, %;  48, 9 – теоретический выход СО₂ из гексозных моносахаридов.

 

Обработка результатов.

 

Определение массы глюкозы, необходимой для  приготовления 250 мл раствора с концентрацией 1,5 %:

 

m_{глюкозы}=250*(1,5/100)=3,75 г

 

Определение титров Фелинга и приготовление 0,1% раствора глюкозы:

 

V₁ = 6,2 мл

V₂ = 6,4 мл       (сливаем сразу 80% от первого объема (4,96мл) ждем 2 минуты и по                                                                                                                                    каплям капаем до появления желтой окраски)

V₃ = 6,2 мл

V_ср = 6,3 мл

 

Т = V * n * 10 = 6,3 * 0,1 * 10 = 6,3

Т – условный титр медно-щелочного раствора по глюкозе, мг;

n – навеска глюкозы, n = 0,1г;

V – объем, пошедший на титрование, мл.

 

Содержание  редуцирующих веществ (Рв) в исследуемой пробе:

 

V _ориент. = 8 мл

V₂ = 7,9 мл       (сливаем сразу 80% от первого объема (6,4 мл) ждем 2 минуты и по                                                                                                                                    каплям капаем до появления желтой окраски)