Теоретические основы электрофоретического разделения белковых смесей

Электрическое поле

Согласно закону Ома, сила тока I (в амперах), напряжение V (в вольтах) и сопротивление R (в омах) связаны следующим соотношением: I = V/R. На разделение ионов и макромолекул в электрическом поле влияют все три фактора.

Сила тока. Поскольку ток в растворе между электродами обусловлен исключительно переносом ионов буфера и образца, скорость их перемещения прямо пропорциональна силе тока. Длина пути, пройденного ионами, будет пропорциональна времени пропускания тока. Следовательно, для максимальной воспроизводимости результатов сила тока в процессе электрофореза не должна меняться. Само собой разумеется, что ток должен быть постоянным.

Напряжение. Оно связано с силой тока приведенным выше соотношением. Отсюда следует, что скорость миграции частиц пропорциональна падению напряжения в поддерживающей среде, или градиенту напряжения, обычно выражаемому в В×см^-1 (приложенное напряжение, деленное на длину слоя носителя). Используются как низкие (100-500В), так и высокие (500-10.000В) напряжения с градиентами до 20 и 200 В×см^-1, соответственно. По причинам, которые будут рассмотрены позднее, высокие напряжения применяют в основном для разделения высокомолекулярных веществ.

Сопротивление. Скорость миграции обратно пропорциональна сопротивлению, которое в свою очередь зависит от типа и размеров носителя и от ионной силы буфера. Сопротивление возрастает с увеличением длины слоя носителя и уменьшается при увеличении его ширины, а также с возрастанием концентрации буферных ионов.

В ходе электрофореза выделяется тепло, количество которого в единицу времени равно I²R (Вт), при этом сопротивление уменьшается. Следовательно, при постоянном напряжении такое нагревание приведет к увеличению силы тока и усиленному испарению растворителя. Для обеспечения максимальной воспроизводимости результатов применяют стабилизированные источники питания, которые автоматически поддерживают на постоянном уровне либо напряжение, либо силу тока, несмотря на неизбежные при температурных флуктуациях изменения сопротивления. Испарение сводят до минимума, помещая аппарат под воздухонепроницаемую крышку. Для дополнительного охлаждения при работе с высоким напряжением в аппарат встраивается охлаждающая система.

Буфер

Буфер формирует и стабилизирует определенное значение рН носителя, а также влияет на скорость миграции веществ.

Состав буфера. Наиболее часто используемыми буферами являются: формиатный, ацетатный, нитратный, вероналовый, фосфатный, Трис и пиридиновый. Для разделения углеводов применяют боратные буферы, преимущество которых заключается в том, что они образуют с углеводами заряженные комплексы.

Поскольку буферы служат для образца  растворителями, некоторая диффузия нанесенного образца неизбежна. Это особенно заметно для малых  молекул, таких, как аминокислоты и сахара. Диффузию можно свести до минимума, если наносить образцы в виде узких полос и в умеренных количествах, использовать высокое напряжение и как можно быстрее проводить разделение, а по его завершении быстро извлекать и высушивать образцы.

Концентрация буфера. По мере увеличения ионной силы буфера компонент тока, обусловленный переносом ионов буфера, будет возрастать, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца, уменьшаться.  Таким  образом, скорость миграции   образца уменьшится. При высокой ионной силе буфера суммарный ток увеличивается, и, следовательно, возрастает количество выделяемого тепла.

При низкой ионной силе ток, обусловленный  переносом ионов буфера, уменьшается, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца, возрастает. Таким образом, миграция образца ускоряется. В буфере с низкой ионной силой общая сила тока и выделение тепла уменьшаются, но возрастает диффузия, вследствие чего разрешающая способность становится ниже, чем при высокой ионной силе.

рН. Для полностью диссоциирующих веществ, таких, как неорганические соли, величина рН буфера практически не играет роли, но в случае органических соединений рН определяет степень ионизации. С ростом рН ионизация органических кислот возрастает, а оснований, наоборот, уменьшается, и, следовательно, меняется их электрофоретическая подвижность. На такие соединения, как аминокислоты, обладающие как кислотными, так и основными свойствами (амфолиты), рН оказывает двоякое действие. Таким образом, скорость и направление движения амфолитов зависят от рН, и для их разделения можно использовать буферы с диапазоном рН от 1 до 11.

Буфер, находящийся в обеих электрофоретических  камерах, обычно идентичен тому, который  используют для насыщения носителя. Однако при гель-электрофорезе, где буфер действует как составная часть носителя, он зачастую отличен от буфера, заполняющего камеры.

Носитель

В качестве носителей используют относительно инертные вещества, однако их состав все же не безразличен для подвижности разных веществ, поэтому выбор соответствующего носителя зависит от природы разделяемой смеси в образце. Основными факторами, имеющими непосредственное отношение к успешному разделению анализируемых смесей, являются следующие свойства носителей: адсорбция, электроосмос и характеристики носителя как молекулярного сита.

Адсорбция. Адсорбция – удерживание молекул образца носителем, как это имеет место при адсорбционной хроматографии. Это явление приводит к размыванию пятен на электрофореграмме, в результате чего образец движется не в виде четкой полосы, а имеет вид пятна с «хвостом». При этом разрешающая способность метода уменьшается. Адсорбция приводит также к уменьшению скорости миграции. Наибольшей способностью к адсорбции обладает бумага, однако это нежелательное ее свойство удается устранить, если использовать ацетат целлюлозы.

Электроосмос (электроэндосмос). Это явление обусловлено возникновением относительного заряда между молекулами воды буферного раствора и поверхностью носителя. Ионизация определенных групп носителя и поверхностная адсорбция ионов буфера обычно приводят к образованию ионов гидроксония (Н₃О⁺). Так как эти ионы заряжены положительно, они движутся к катоду, захватывая растворенные нейтральные вещества и ускоряя движение катионов; скорость движения анионов при этом снижается. Обычно данным эффектом пренебрегают, однако, если нужно определить изоэлектрическую точку вещества, следует вводить соответствующую поправку. Как правило, это делают, следя за движением электрически нейтральных соединений, таких, как мочевина или глюкоза. Электроосмос менее заметен в носителе из ацетата целлюлозы или в полиакриламидном геле, чем в крахмальном геле или на бумаге.

Молекулярное сито. Свойствами молекулярного сита обладают применяемые в электрофорезе полужесткие носители-гели. Свойства гелей способствуют разделению смесей заряженных макромолекул, например белков, которые различаются не только электрофоретической подвижностью, обусловленной зарядом, но также формой и размерами. Гели состоят из беспорядочно переплетающихся полимерных молекулярных цепей, распределенных по всему объему геля и образующих ситоподобную структуру. В соответствии с конкретными требованиями разделения размер пор гелей можно изменять в некоторых пределах. Принцип действия молекулярного сита в агаровом, крахмальном и полиакриламидном гелях заключается в том, что крупные молекулы движутся сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор, который определяется числом поперечных сшивок в геле. При использовании гелей типа сефадекса ситуация обратная – в соответствии со спецификой их природы миграция малых молекул тормозится сильнее, чем крупных.

1.Электрофорез с подвижной границей

 Это  первый электрофоретический метод и следования белков. А. Тизелиус (1930) предложил использовать для разделения биомолекул U-образную электрофоретическую ковету с прямоугольным попересным сечением, заполненную необходимым буфером. Кювету помещают  в термосттатированную баню с пониженной температурой +2 0С, что ослабляет конвекционную неустойчивость границ раздела, возникающую из-за теплового воздействия электрического тока.

Белковый раствор диализируют  против буфера, а затем помещают в нижнюю секцию одного из колен  трубки. В системе применяют обратимые  электроды Ag/AgCl, KCl. Для предотвращения загрязнения продуктами электролиза электроды помещают на дно достаточно больших по объему сосудов (2,5 л). Сила тока во время проведения элекрофореза составляет 20 мА, напряжение– 200 В, а общая используемая мощность - порядка 6 Вт. Продолжительность электрофореза занимает в среднем 2-3 часа. Под воздействием сил электрического поля частицы движутся в сторону электрода с противоположным зарядом и компоненты, имеющие одинаковый заряд. группируются в одну фракцию. положение мактромолекул во время электрофореза, т.е. границу, отделяющую раствор белка от растворителя, определяют с помощью астигматической фотокамеры со специальной оптической системой, так называемой шлирен-оптики, которая позволяет регистрировать градиент показателя преломления вдоль электрофоретической трубки.

Этот аналитический  метод применяют для определения  величины электрофоретической подвижности  и изоэлектрической точки белков, для выявления гетерогенности белковых препаратов. Из-за диффузии  границы  раздела жидкостей не могут быть идеально четкими, поэтому количественно определять электрофоретическую подвижность разделяемых веществ достаточно трудно. В настоящее время метод электрофореза с подвижной границей применяется редко.

2. Изоэлектрическое фокусирование

Изобратателями метода изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) считаю R.R. Williams, R.E. Waterman (1929), которые четко четко сформулировали его основные принципы.

При изоэлектрическом фокусировании  разделение амфотерных соединений (аминокислот, пептидов, белков и др.) осуществляется в системе с градиентом рН. Разделение разных белков методом ИЭФ возможно благодаря тому, что они значительно различаются по своим изоэлектрическим точкам, т.е. по значениям рН, при котором заряд молекулы равен нулю.

Существует несколько  приемов формирования рН:

-  путем простого наслоения ряда буферных растворов с постепенно изменяющимися значениями рН;

-   за счат создания в буферной системе температурного градиента;

- в результате образования градиента конценрации полиспиртов в боратном буфере;

-   с помощью амфолитов-носителей.

Последний способ получил  самое широкое практическое применение и вытеснил все остальные. В настоящее  время под ИЭФ часто подразумевают  электрофоретическое разделение веществ  в среде, содержащей амфолиты-носители.

Низкомолекулярные амфолиты-носители представляют собой готовую смесь алифатических полиаминополикарбоновых кислот, каждый компонент этой смеси при растворении в воде стремится приблизить рН раствора к своему значению рI. амфолиты при наложении электрического поля мигрируют и концентрируются в узких зонах своих изоэлектрических точек. В итоге в геле создается стабильно заданный градиент рН. в результате диффузии и близости значений рI соседних амфолитов границы между зонами сглаживаются и получается практически линейный градиент рН. Интервал значений рН зависит от состава амфолитов, т.е. от интервала значений изоэлектрических точек самих амфолитов. Попадая в такую систему, белки и другие амфотерные молекулы начинают мигрировать в соответствии со своим поверхностным зарядом, при этом перемещении величина их заряда будет постоянно меняться (уменьшаться) до тех пор, пока молекула не достигнет зоны, где ее заряд не станет равным нулю. Это произойдет в том месте градиента рН, в котором значение рН окажется равным ИЭТ молекулы. В итоге миграции белковой молекулы прекращается.

Любое перемещение белка  из-за процессов диффузии сопровождается восстановлением его заряда, а ,следовательно, и электрофотометрической миграцией  в обратном направлении. В результате амфотерные молекулы достигают своего положения равновесия. вблизи которого они концентрируются в виде очень узких полос. Все молекулы белка с одинаковыми величинами ИЭТ соберуться в одну узкую зону. Белковые молекулы, имеющие разные значения рI, сфокусируются в различные зоны. Таким образом осуществляется разделение смеси белков по значениям рI ее компонентов. Метод ИЭФ- удобный и надежный метод определения ИЭТ биологических амфотерных соединений. Для этого достаточно измерить величину рН в зоне концентрирования исследуемого вещества. Осуществить эту процедуру можно путем наложения микроэлектрода на поверхность разделяющего геля. Если микроэлектрода нет, то гель нарезают на тонкие полоски и участки, а затем измеряют рН каждого участка после элюции из него амфолитов-носителей водой. Обычно используют два геля: один- для определения белка, другой- для регистрации значений рН (градиента рН). Метод ИЭФ обладает высокой разрешающей способностью, позволяет разделять белки, различающиеся по величине рI всего на 0,02 и идентифицировать изоферменты. С его помощью осуществляют фракционирование  таких белков, которые нельзя раздеоить другими методами. Кроме того, в процессе изоэлектрического фокусирования происходит значительное концентрирование разделяемых веществ. что делает возможным дальнейшее исследование их физико-химических характеристик.

3. Зональный электрофорез и его разновидности зонального электрофореза

 Как метод аналитического  исследования  зональный электрофорез  имеет определенные преимущества  перед метод электрофореза с  подвижной границей: он позволяет использовать более простую аппаратуру; применять для разделения очень небольшие количества исследуемого биологического вещества; расширяет круг анализируемых соединений; позволяет осуществлять ниаболее  полное разделение всех электрофоретически различаемых компонентов. Кроме того, отдельные составляющие исследуемой смеси, различающиеся по зарядам , а иногда и по массе, и проявляющиеся как дискретные зоны на поддерживающем носителе, могут быть впоследствие идентифицированы различными физическими, химическими, биохимическими, иммунологическими и другими методами. Зональный электрофорез служит для определения относительной электрофоретической подвижности вещества, а не истинной (абсолютной)подвижности.

При зональном электрофорезе слой поддерживающей среды размещается между камерами с электродами, все заполняется буферным раствором, смесь молекул наносится на границу поддерживающего слоя и разделяется под действием тока на зоны отдельных компонентов, мигрирующих в однородном электрическом поле и в однородной среде в соответствии со своими подвижностями. Следует отметить, однако, что движение ионов в электрическом поле в любом растворе не вполне свободно, так как в любой точке раствора поддерживается постоянной, не зависящей от времени, следующая величина, называемая управляющей функцией Кольрауша: Σc_j/u _j = const., где c_j –концентрация j-го компонента раствора, u _j –его подвижность. Движение анализируемых молекул можно считать свободным только в том случае, когда определяющим в этой функции является вклад ионов среды.