Химико – токсикологический анализ допинговых средств

Анализ, как правило, должен быть проведен в течение 72 ч после получения  проб лабораторией. В отдельных случаях в связи с ее загруженностью этот срок может быть увеличен до 5 рабочих дней с момента доставки проб в лабораторию.

В случае положительного результата пробы А лаборатория немедленно извещает спортсмена о:

• положительном результате анализа;
• праве спортсмена на немедленный запрос на проведение анализа пробы В (отсутствие запроса в течение 7 дней после извещения спортсмена является юридическим основанием считать результат положительным);
• праве спортсмена и/или его представителя присутствовать при вскрытии и анализе пробы В, если на этот анализ был подан запрос;
• праве спортсмена подать запрос на предоставление ему копий документации по анализам проб А и В, предусмотренной в Международных Стандартах для лабораторных анализов.

Распространение информации о результатах анализа пробы А не допускается. Если результат пробы В не подтверждает результат анализа пробы А, то результат анализа считается отрицательным.

При положительном результате в  пробе А спортсмен отстраняется от участия в соревнованиях до вынесения решения о санкциях. Контрольное исследование проводится не позднее 7 дней с момента получения запроса о проведении пробы В от спортсмена. В присутствии комиссии из 3 человек производится осмотр и вскрытие пробы В, о чем составляется соответствующий акт. Отсутствие спортсмена, представителя спортивной организации не является препятствием для проведения контрольного исследования. Результат контрольного исследования пробы В является окончательным и пересмотру не подлежит.

Нарушением антидопинговых правил являются:

• присутствие запрещенных субстанций или их метаболитов или маркеров в пробе, взятой у спортсмена;
• использование или попытка использования запрещенной субстанции;
• отказ или непредоставление проб после того, как спортсмен был проинформирован о необходимости их сдачи, если не будут документально подтверждены уважительные причины непредоставления пробы или уклонения от сдачи проб;
• нарушение существующих требований относительно доступности спортсмена для взятия у него проб во время внесоревновательного периода, включая непредоставление информации о местонахождении спортсмена и пропуски очередных тестирований;
• фальсификация или попытка фальсификации в любой сфере допинг – контроля;
• обладание запрещенными субстанциями;
• распространение любой запрещенной субстанции;
• назначение или попытка назначения спортсмену любой запрещенной субстанции или содействие, подстрекательство, помощь, потворство, укрывательство и любой другой вид соучастия в нарушении антидопинговых правил или в попытке нарушения.

Пробы для допинг – контроля должны анализироваться только в лабораториях, аккредитованных ВАДА. Выбор конкретной лаборатории, аккредитованной ВАДА, для анализа взятых проб определяется исключительно антидопинговой организацией, ответственной за результаты анализа. При этом указанные пробы должны анализироваться исключительно на предмет обнаружения в них запрещенных субстанций или использования запрещенных методов, указанных в Списке, а также дополнительно указанных ВАДА субстанций.

Особые требования предъявляются  ВАДА к аналитическим лабораториям и качеству проводимых ими исследований. Для получения аккредитации ВАДА лаборатории должны удовлетворять жестким требованиям и пройти несколько ступеней тестирования и проверки на техническую компетентность и независимость.

В первую очередь кандидаты на получение  аккредитации должны в своей работе неукоснительно следовать требованиям  международных организаций по стандартизации и качеству проведения исследований (ISO, OECD, EU), основываясь на положениях GLP. Для российских условий данное положение основано на получении регистрации в Государственном реестре Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии на соответствие требованиям Системы аккредитации аналитических лабораторий (центров), а также требованиям ГОСТ Р ИЗО/МЭК 17025 на техническую компетентность и независимость.

Дальнейшие шаги для получения  аккредитации ВАДА основываются на подготовке пакета документов, в которых раскрывается работа лаборатории: наличие оборудования, стандартов исследуемых веществ и методического обеспечения проведения исследований, квалификация персонала, а также вопросы финансирования, объемы планируемых работ и ряд других. Эти документы рассматриваются ВАДА, после чего наступает этап преаккредитации. В течение этого этапа лаборатория получает 3 серии проб мочи в течение 6 – 12 мес, которые она должна протестировать на присутствие запрещенных веществ или их метаболитов. При успешном прохождении данного этапа наступает этап собственно аккредитации. В этот период лаборатории дается задание провести исследование 10 подготовленных ВАДА проб, которые она должна проанализировать за 3 дня. При этом за ходом анализа наблюдает комиссия экспертов ВАДА. Лишь получив правильные ответы по всем 10 пробам, а также положительное заключение комиссии, лаборатория может рассчитывать на получение аккредитации.

Получившие аккредитацию ВАДА лаборатории  имеют право проводить исследования проб, изъятых в ходе международных соревнований самого высокого уровня. Для поддержания работоспособности своих лабораторий ВАДА осуществляет комплекс мер, в который входит реаккредитация, заключающаяся в предоставлении лабораториям раз в квартал 5 контрольных проб, которые они должны проанализировать в ходе обычных рутинных процедур и подготовить расширенный отчет по каждой из них. Данный отчет рассматривается компетентной комиссией и в случае неправильной идентификации или ошибки в количественном определении хотя бы одного из веществ принимается решение о лишении данной лаборатории аккредитации (обычно) или снижении ее статуса.

Для проверки квалификации отдельных  сотрудников, кроме проб по реаккредитации, время от времени лаборатория  получает образцы так называемого  профессионального теста, который  заключается в исследовании образцов на присутствие отдельных групп  контролируемых веществ или даже отдельных веществ и их метаболитов. Высокий уровень квалификации сотрудников лабораторий поддерживается на ежегодных встречах, на которых обсуждаются вопросы развития аналитических методов определения допингов, последние научные разработки и достижения в этой области.

 

5. Методы исследования  и интерпретация полученных результатов.

При проведении допинг – контроля аккредитованными ВАДА лабораториями  используется комплекс химических, биологических  и физико – химических методов. Проводится многоэтапное исследование, предусматривающее скрининговое предварительное исследование с целью выявления в большом количестве образцов тех, для которых требуется проведение подтверждающих исследований. Огромное значение придается доказательству точной химической структуры обнаруженного вещества и/или продуктов его метаболизма.

 

Схема проведения допинг – контроля образца мочи.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

В зависимости от полученного результата при исследовании пробы А осуществляются дальнейшие мероприятия. При отрицательном результате считается, что допинговое средство не обнаружено.

Иначе проводится контрольный анализ пробы Б.

Необходимо отметить, что процедура  проведения контрольного анализа (где, в какие сроки, кто и в чьем присутствии, а также интерпретация  полученных результатов и другие действия) строго регламентирована ВАДА. Например, грубейшим нарушением считается разглашение результатов исследования пробы А. Только получение повторного положительного результата в пробе Б является основанием для объявления спортсмена лицом, употреблявшим запрещенные допинговые средства.

Перечень запрещенных веществ  и методов показывает, что тестирование одного спортсмена должно включать несколько  процедур, каждая из которых призвана выявлять присутствие отдельных  групп допингов. Соответственно для каждого анализа должна отбираться отдельная аликвота исследуемого образца мочи. В зависимости от поставленной задачи количество аликвот может доходить до 8 и более, при этом каждая из них подразумевает проведение исследования по собственной схеме.

В соответствии с этой схемой исследование на стимуляторы и наркотики включает 2 процедуры. Первая основывается на исследовании свободной фракции веществ в  моче, для чего аликвота мочи экстрагируется неполярным органическим растворителем  при рН 11,0. Предварительное исследование осуществляется на газовом хроматографе с азотно – фосфорным детектором, а подтверждение результатов – методом ГХ – МС. Для исследования некоторых наркотиков проводится гидролиз мочи (щелочной либо энзиматический), экстракция неполярным растворителем, дериватизация трифтороуксусным ангидридом и определение методом ГХ – МС в режиме регистрации селективных ионов. Подтверждение полученных результатов проводят путем сравнения получаемых масс – спектров с масс – спектрами аналитических образцов сравнения. 

В анализе допинговых средств, кроме  указанных, используют другие методики дериватизации, в результате чего получают производные, в которых полярные группы замещены различными фрагментами. Например, при анализе β – блокаторов после проведения гидролиза аликвоты мочи получают двойные ТМС – ТФА – производные. Такой же подход применяют при количественном определении стимуляторов из группы эфедрина: эфедрина и псевдоэфедрина, фенилпропаноламина, фоледрина и катина. В анализе диуретиков методом ГХ – МС лучшими характеристиками обладают их метильные производные.

Наиболее сложным в допинг –  контроле является исследование мочи на присутствие анаболических стероидов. Это обусловлено их низкой концентрацией  в моче, большим числом метаболитов и веществ эндогенного характера, близких по химической структуре.

История допинг – контроля имеет  многочисленные подтверждения того факта, что только использование  современных разработок и последних  достижений аналитической химии  приводит к успешному результату.

Ограничением этого подхода  является тот факт, что на хроматограмме  на месте выхода основного метаболита метандиенона появляется еще один хроматографический пик, соответствующий эндогенному веществу и имеющий близкий по внешнему виду масс – спектр низкого разрешения. Разделить эти два вещества хроматографически достаточно трудно. Решить вопрос позволяет использование масс – спектрометрии высокого разрешения.

Определение тестостерона как допинга  была и остается одной из самых  сложных задач в современном допинг – контроле. Природный тестостерон циркулирует в крови, интенсивно метаболизирует, превращаясь в так называемые 17 – кето – метаболиты, прежде всего андростерон и его производные. Эти метаболиты выводятся с мочой. Тестостерона в ней очень мало. Допинговый, т.е. полученный извне, тестостерон также вовлекается в интенсивный метаболизм. После введения тестостерона его концентрация вначале увеличивается, потом плавно снижается, однако эта динамика видна только при лабораторном эксперименте. При допинговом контроле имеется всего одна проба с определенной концентрацией. Измерение этой одной концентрации ничего не дает, так как естественный тестостерон присутствует в моче мужчин и женщин в довольно широком диапазоне концентраций – от 10 до 100 нг на 1 мл и более.

В 1984 г. проф. М. Донике, основатель и директор Института биохимии спорта, - так он сам называл свою всемирно известную антидопинговую лабораторию в Кельне – предложил измерять не концентрацию тестостерона, а соотношение концентраций тестостерона (Т) и эпитестостерона (Е), его природного изомера. Введение тестостерона резко изменяло соотношение Т/Е. За норму соотношения Т/Е была взята 1. Хотя разброс значений Т/Е был тоже велик – от 0,1 до 3,5 и выше, тем не менее при Т/Е более 6 можно утверждать, что это проба положительная.

В начале ХХI века лаборатории начали осваивать новый метод определения тестостерона, так называемый изотопный, основанный на том, что соотношение изотопов атомов углерода в молекуле синтетического тестостерона отличается от такового соотношения у природной молекулы. Это сложный метод, требующий больших затрат и на приобретение оборудования, и на проведение анализа. Он применяется в том случае, если соотношение Т/Е превышает 4.

Опыт последних лет показал, что только одна или две пробы из 100 демонстрируют изотопное соотношение, свидетельствующее о внешнем, экзогенном, происхождении тестостерона, т.е. если у  спортсмена соотношение Т/Е было достаточно большое, вплоть до 10, то пик тестостерона представляет собой смесь своего, природного, и экзогенного тестостерона и метод изотопного соотношения оказывается бесполезен. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список используемой литературы

 

1. Токсикологическая химия. Аналитическая токсикология: учебник / Под ред. Р.У. Хабриева, Н.И. Калетиной. – М. : ГЭОТАР_Медиа, 2010. – 752 с. : ил.
2. Карпов Ю.А., Савостин А.П. Методы пробоотбора и пробоподготовки. – М., 2003.
3. Токсикологическая химия: учебник/ Т.Х. Вергейчик; под ред. проф. Е.Н. Вергейчика. – М.: МЕДпресс – информ, 2009. – 400с.:ил.
4. Швайкова М. Д. Токсикологическая химия.— М.: Медицина, 1975.—376 с.
5. Крамаренко В. Ф. Химико-токсикологический анализ.— К-: Вища шк. Головное изд-во, 1982.— 272 с.