Дослідження ролі стафілококів у розвитку гнійно-запальних процесів

З лабораторних даних  часто виявляється лейкоцитоз, підвищується вміст білірубіну сироватки крові (у 70%), підвищується активність сироваткових амінотрансфераз (у 77%), у частини хворих відзначається інтерстиціальна інфільтрація в легенях.

Стафілококова ангіна має мало особливо характерних рис. Клінічно мало відрізняється від стрептококової, вона погано піддається лікуванню пеніциліном, іноді на шкірі з'являється дрібнокрапковий висип, проте без бактеріологічного дослідження диференціювати важко.

Стафілококовий  ендокардит характеризується ураженням клапанів серця і є результатом гематогенної дисемінації збудника. Стафілококи є другою за частотою причиною ендокардиту, найчастіше у наркоманів. Часто захворювання виникає у осіб похилого віку, нерідко у госпіталізованих з приводу якого-небудь хронічного захворювання. Ендокардит починається гостро з високого підйому температури тіла, прогресує анемізація. Виявляється і прогресує недостатність сердцевих клапанів, у 90% хворих з'являються сердцеві шуми. Можуть утворитися абсцеси клапанного кільця і міокарду, летальність досягає 20-30%. У наркоманів частіше вражається тристулковий клапан. Захворювання нерідко супроводжується інфарктами легенів. У хворих з клапанними протезами найбільш частою причиною ендокардиту (до 40%) є не золотистий, а епідермальний стафілокок, інфікування яким відбувається частіше під час операції, а клінічні прояви виявляються лише через рік [38].

Стафілококові пневмонії і плеврити мають тяжкий перебіг. Вогнища інфекції в легенях мають тенденцію зливатися, з'являються гнійні ускладнення, виражені дихальна недостатність і інтоксикація. Стафілококові пневмонії можуть бути первинними, а також розвиватися у вигляді ускладнення на тлі інших, в основному, вірусних інфекцій (грип, парагрип, аденовірусні захворювання, кір, мікоплазмоз та ін.). Частота стафілококових пневмоній складає близько 10% усіх гострих пневмоній. Клінічно стафілококові пневмонії відрізняються важчим перебігом, вираженою задишкою, ціанозом, схильністю до гнійних ускладнень (абсцеси, емпієми). Рентгенологічно відрізняються своєрідними емфізематозними розширеннями у вигляді повітряних бульбашок або круглих кіст, які виявляються разом з паренхіматозними інфільтративними змінами.

Гострі стафілококові  ентерити і ентероколіти. Вони супроводжуються рясною водянистою діареєю, що загрожує швидким зневодненням організму. Отруєння стафілококовим ентеротоксином відбувається при вживанні в їжу продуктів, заражених стафілококом. Токсин може накопичуватися у великих кількостях в їжі, що несе в собі велику небезпеку. Найбільш небезпечні в цьому відношенні молочні продукти. Стафілококовий менінгіт і абсцес мозку розвиваються в результаті стафілококового сепсису (зараження крові). Стафілококові захворювання сечових шляхів зазвичай не відрізняються від патології іншого походження. Їх збудниками частіше є сапрофітні стафілококи, які є другою після кишкової палички причиною первинної інфекції сечових шляхів у молодих жінок (до 20%), клінічно не відрізняється від захворювань сечових шляхів іншої етіології, лихоманка і ознаки загальної інтоксикації відсутні.

Стафілокок також є  частим збудником ряду запальних  захворювань очей, в першу чергу, ячменів і кон'юнктивітів [23].          

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. ЛАБОРАТОРНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ БАКТЕРІЙ РОДУ STAPHYLOCOCCUS

 

Основний метод лабораторного дослідження – бактеріологічний; розроблені та впроваджені серологічні реакції. У випадку необхідності (при інтоксикаціях) проводять біологічну пробу. Матеріалом для бактеріологічного дослідження служить кров, гній, слиз із зіва, носу, відокремлюване ран, мокротиння (при стафілококовій пневмонії), випорожнення (при стафілококовому коліті), у випадку харчових інтоксикацій – блювотиння, випорожнення, промивні води шлунку, підозрілі продукти. Матеріал засівають на кров’яний агар (гемоліз), на молочно-сольовий (молочно-жовточно-сольовий) агар (пригнічується ріст сторонніх бактерій за рахунок NaCl, на якому виявляють пігменти та лецитиназну активність). Виділену культуру ідентифікують за видовими ознаками, визначають у неї наявність основних ознак та факторів патогенності (золотистий пігмент, зброджування маніту, гемоліз, плазмокоагулазну активність), обов’язково перевіряють чутливість культур до антибіотиків, у випадку необхідності проводять фаготипування [18]. З числа серологічних реакцій для діагностування гнійно-септичних захворювань застосовують РПГА (реакція пасивної гемаглютинації) та ІФМ (імуноферментний метод), зокрема для визначення антитіл до тейхоєвої кислоти або до видоспецифічних антигенів. Для визначення ентеротоксигенності стафілококів використовують три методи:

• Серологічний – за допомогою специфічних антитоксичних сироваток в реакції преципітації у гелі виявляють ентеротоксин та встановлюють його тип;
• Біологічний – внутрішньовенне введення бульйонної культури стафілококу кішкам у дозі 2-3 мл на 1 кг маси тіла. Токсини викликають у кішок блювоту та пронос;
• Непрямий бактеріологічний метод – виділення чистої культури стафілококу та визначення основних факторів патогенності (утворення ентеротоксину корелює з наявністю інших факторів патогенності, зокрема РНК-ази). Найбільш простим та чутливим є серологічний метод виявлення ентеротоксину [18].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЕКСПЕРЕМЕНТАЛЬНА  ЧАСТИНА

6. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єктом дослідження  були штами стафілококів, виділені з різного клінічного матеріалу  від пацієнтів відділень гнійно-септичної  хірургії, урології, гінекологічного відділення, травматології ортопедичної та отоларингологічного відділень міської лікарні № 7 м. Дніпродзержинськ. Інтерпретація результатів була проведена за допомогою програми WHONET — міжнародної комп’ютерної програми для моніторінгу антибіотикорезистентності.

6.1 Методи виділення та ідентифікації стафілококів                                                                 

 

Для визначення приналежності стафілококів та їх фізіолого-біохімічних  властивостей використовували стандартні тести згідно з наказом МОЗ  № 535 «Про уніфікацію мікробіологічних (бактеріологічних) методів дослідження, застосовуваних у клініко-діагностичних установах». Культури виділяли шляхом висіву на ЖСА (жовточно-сольовий агар), який готували у такий спосіб: до стерильного, розплавленого і охолодженого до 48⁰С МПА (рН 7,2-7,4) з 7,5-10% натрію хлориду додавали 15-20% за об’ємом стерильній жовтковій емульсії (з добре вимитого і обпаленого спиртом яйця витягували жовток і розбивали його в 150-200 мл стерильного фізіологічного розчину). Середовище швидко перемішували і розливали в чашки Петрі [18]. Виділені чисті культури стафілококів досліджували за такими тестами: плазмокоагулазна та лецитиназна активність, ферментація маніту в анаеробних і окиснення маніту в аеробних умовах.

Плазмокоагулазна  активність. В пробірку вносили за допомогою бактеріологічної петлі добову агарову культуру дослідного штаму, яку суспендували у цитратній плазмі кролика. Штатив з пробірками поміщали в термостат при 37⁰С та реєстрували результат реакції через 1, 2, 4 та 18 годин інкубації. Появу на дні пробірки згустку враховували як позитивний результат. За результатами тесту культури були віднесені до коагулазонегативних та коагулазопозитивних штамів.

Лецитиназна активність. Наявність лецитинази визначали на середовищі, яке готували таким чином: до 200 мл середовища (з 1,8 % живильного агару і 7,5 % NaCl) додавали молочно-жовточну суміш. Готове середовище містило приблизно 10 % молока та 1 % яєчного жовтка. Інкубували посів протягом 18-24 годин при температурі 37⁰С. Для обліку наявності пігменту додатково інкубували чашки з посівами протягом 18-24 годин при кімнатній температурі. На наявність лецитинази вказувала поява навколо колонії райдужного вінчика.

Ферментація маніту в анаеробних умовах. Для виявлення цієї здатності готували напіврідке середовище з 0,3 % агаром і 1 % розчином маніту, до якого вносили індикатор бромтимоловий синій. Добову агарову культуру за допомогою петлі засівали у стовпчик середовища уколом до дна пробірки, а потім на поверхню агара наливали 1,5 мл стерильного вазелінового масла для створення анаеробних умов. Посів інкубували при 37⁰С протягом 5 діб, кожен день реєстрували результати. Наявність жовтого забарвлення стовпчика середовища не менш ніж 2/3 його висоти свідчила про позитивну реакцію.

Належність дослідної культури до Staphylococus epidermidis визначали за здатністю до окиснення маніту. Для постановки тесту готували тверде живильне середовище з 1,8 % агаром, 1 % розчином маніту та індикатором ВР наступного складу: хлористий натрій – 5,0 г; магній сірчанокислий – 0,2 г; амоній фосфорнокислий одно заміщений – 1,0 г; калій фосфорнокислий двозаміщений – 1,0 г; ацетамід – 20 г; агар-агар – 15,0 г; дистильована вода –1000 мл. Добові агарові культури дослідних штамів висівали на підготовлене середовище. Посів інкубували при 37⁰С. Результати реєстрували через 1 добу. Поява жовтого забарвлення навколо колонії свідчила про позитивну реакцію [18].

6.2 Методи визначення чутливості виділених штамів до антибіотиків

 

 Інтерпретація результатів була проведена за допомогою програми WHONET — міжнародної комп’ютерної програми для моніторингу антибіотикорезистентності. Ця програма дозволяє слідкувати за тенденціями розвитку резистентності виділених штамів у різних регіонах та лікарнях. В її основі лежать стандарти CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, USA).

Для визначення чутливості дослідних штамів до антибіотиків використовували метод дифузії в агар із застосуванням стандартних паперових дисків. Для цього використовували середовище Мюллера – Хінтона (на 1 літр середовища – м’ясопептонний порошок – 2,0г, дегідратований казеїн – 17,5г, крохмаль – 1,5г, агар – 17г). Вміст іонів кальцію та магнію в середовищі відповідав встановленим нормам (мінімум 60 мкг/мл кальцію та 20 мкг/мл магнію). Середовище Мюллера-Хінтона бідне на тимідин, тому збалансований вміст іонів кальція та магнія забезпечує більшу точність у визначенні діаметрів зон пригнічення росту навколо дисків з антибіотиками. Висота слою агарового середовища складала  4 мм. рН середовища – 7,2-7,4. Перед застосуванням чашки із  середовищем Мюллера-Хінтона витримували протягом 30 хв. при температурі 35ºС, для того, щоб видалити надлишок вологи.

На поверхню середовища наносили 1 мл суспензії  добової чистої досліджуваної культури в ізотонічному розчині хлориду  натрію (густота суспензії відповідно стандарту Макфарланда), потім скляним  шпателем розподіляли по поверхні середовища, витримували 15 хвилин при кімнатній температурі, надлишок суспензії видаляли за допомогою піпетки. Потім на поверхню середовища поміщали диски з антибіотиками. Диски злегка вдавлювались в агар за допомогою пінцета, стерилізованого в полум’ї і охолодженого. Відстань між дисками становила не менше 24 мм, а відстань між диском і краєм чашки Петрі – не менше 1 см. Чашки витримували в термостаті при температурі 37ºС 18-24 годин. Діаметр зон вимірювали зі сторони чашки Петрі. Відсутність зони затримки росту мікроорганізмів та наявність зони діаметром до 10 мм вказували на те, що випробовуваний штам стійкий до даного препарату. Зони діаметром від 11 мм до 20мм свідчили про проміжний результат, а від 21мм – про високу чутливість мікроорганізмів («чутливі» (S), «проміжний результат» (I), «стійкі» (R)) [8].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7. РЕЗУЛЬТАТИ  ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ 

7.1 Дослідження  поширення стафілококів серед  пацієнтів міської               багатопрофільної лікарні № 7 м. Дніпродзержинськ

Незважаючи  на значну увагу з боку дослідників, стафілококові інфекції залишаються актуальною проблемою сучасної медицини. Стафілококи здатні викликати захворювання усіх систем органів людини. У зв’язку з цим нами було досліджено розповсюдження стафілококових інфекцій у 606 пацієнтів 5 стаціонарних відділень міської багатопрофільної лікарні №7 м. Дніпродзержинськ.

Мікробіологічний  матеріал було отримано з відділення гнійної хірургії, травматології, урології, гінекології та ЛОР-відділення (рис. 7.1).

   

 

Рисунок 7.1 Видовий склад виділених штамів стафілококів

З клінічного матеріалу  від 606 пацієнтів міської лікарні №7 м. Дніпродзержинська виділено 606 штамів бактерій, які за комплексом культуральних та фізіолого-біохімічних ознак віднесено до роду Staphylococcus.

Найбільш часто  виділявся золотистий та гемолітичний стафілококи: 319 ізолятів (57%) були представлені Staphylococcus aureus, 274 (40%) – S. haemolyticus. Зовсім незначний відсоток виділених культур приходився на два інші види стафілококів. Так, 10 із 606 виділених культур (2%) було ідентифіковано як S. saprophyticus і 3 (1%) – як   S. epidermidis.

Такий значний  відсоток виділення штамів золотистого  стафілококу можна пояснити тим, що саме цей мікроорганізм найчастіше за всі інші види стафілококів є  причиною внутрішньолікарняних і позалікарняних інфекцій, у зв’язку із наявністю різноманітних факторів патогенності, значною стійкістю до широкого спектру антимікробних препаратів та високою частотою поміжштамової передачі генетичних факторів, у яких закодовано ці властивості.

 

7.2 Аналіз виділення стафілококів у пацієнтів різних відділень лікарні

 

Одним із завдань  роботи було дослідження розповсюдження і аналіз видового складу стафілококів у пацієнтів кожного з 5 відділень міської лікарні (табл. 7.1 – 7.4).  

          Таблиця7.1

Видовий склад бактерій роду Staphylococus  у пацієнтів відділення гнійної хірургії

№  п/п	Види виділених штамів стафілококів	Кількість виділених  штамів	Частота виявлення,%
1.	S. aureus	239	75,6
2.	S. epidermidis	2	0,6
3.	S. saprophyticus	71	22,5
4.	S. haemolyticus	4	1,3
5.	Загальна кількість	З16	100 %