Изменение фосфолипидного состава мембран

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ  БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

 «МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ 

ИМЕНИ Н. П. ОГАРЁВА»

 

Факультет биологический

 

Кафедра биотехнологии

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА ЛИПИДОВ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ ГОЛУБЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И АНТОЦИАНОВ СМОРОДИНЫ И ЕЖЕВИКИ

 

Автор курсовой работы     ___________________                        Л. А. Дерова                                                                          

Специальность          240901  Биотехнология

Обозначение курсовой работы         КР-02069964-240901-08-12

Руководитель работы                              

канд. биол. наук, доцент     ___________________                     А. А. Девяткин

 

                                                Оценка  

 

 

 

 

 

 

 

Саранск

2012

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ  БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

 «МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Н. П. ОГАРЁВА»

 

Факультет биологический 

 

Кафедра биотехнологии

 

ЗАДАНИЕ НА КУРСОВУЮ РАБОТУ

 

Студент  Л. А. Дерова

1 Тема   Изменение состава липидов мембран эритроцитов крови голубя при действии окислительного стресса и антоцианов смородины и ежевики

2 Срок представления работы  к защите_________________________

3 Исходные данные для  научного исследования литературные данные

4 Содержание курсовой  работы

 

4.1  Введение           

4.2  Аналитический обзор

4.3   Материалы и методы исследования 
           4.4  Результаты и их обсуждение 
           4.5  Выводы 
           4.6  Список использованных источников        

 

 

Руководитель работы                  ____________                     А. А. Девяткин

Задание принял к исполнению ____________                 

 

 

Реферат

 

Курсовая  работа   содержит 41 страницу печатного текста,  5  рисунков, 2 таблицы, 35 использованных литературных источников, из них 12 иностранных.

ПРОГРАММИРУЕМАЯ ГИБЕЛЬ КЛЕТКИ И ЕЕ ФОРМЫ, ИНДУКТОРЫ, АНТОЦИАНЫ, ПЕРИКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ, ФОСФОЛИПИДЫ

Объектом исследования являются липиды мембран эритроцитов голубя

Цель работы – изучить изменение состава липидов мембран эритроцитов крови голубя при действии окислительного стресса и антоцианов смородины и ежевики.

В процессе практики использовались методы экстракции и тонкослойной хроматографии.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание

 

Обозначения и сокращения 5

Введение 6

1 Аналитический обзор 7

  1.1 Общая характеристика и значение различных путей программируемой

  клеточной гибели  7

  1.1.1 Молекулярные механизмы путей и гены программируемой

  клеточной   гибели 13

  1.2  Окислительный стресс 18

  1.3 Антиоксидантная система 19

  1.3.1  Роль флавоноидов как антиоксидантов 20

2  Материалы и методы  исследования 23

  2.1 Объект исследования 23

  2.2 Методы исследования 23

  2.2.1 Выделение флавоноидов 23

  2.2.2 Разделение флавоноидов методом ТСХ 24

  2.2.3 Микроскопия 25

  2.2.4 Выделение общих липидов по методу Блайя-Дайера 25 

  2.2.5 Тонкослойная  хроматография липидов 26

  2.2.6 Количественное определение фосфолипидов 28

3 Результаты и их обсуждение 30  

   3.1 Изменение фосфолипидного состава мембран эритроцитов под действием нитропруссида натрия и антоцианов ежевики 30

   3.2 Изменение фосфолипидного состава мембран эритроцитов под действием нитропруссида натрия и антоцианов ежевики 34  

Выводы 37  

Список использованных источников 38 

Обозначения и  сокращения

 

АОС – антиоксидантная система

АТФ – аденозинтрифосфорная кислота

АФК - активные формы кислорода

АФ - аутофагосомы

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛФХ – лизофосфотидилхолин

НК – нуклеиновые кислоты

НП – нитропруссид натрия

ПОЛ – перекисное окисление  липидов

РНК – рибонуклеиновая  кислота

CMА - шаперон - ассоциированная аутофагия 

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФИ – фосфатидилинозитол

ФС – фосфатидилсерин

ФХ – фосфатидилхолин

ФЭА – фосфатидилэтаноламин

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

Регуляция процесса клеточной  гибели является одной из центральных проблем биологии клетки и интенсивно изучается сейчас во всем мире. Интенсивность исследований в этой области не ослабевают, поскольку решение проблемы увеличения срока жизни клетки имеет прямое отношение к поддержанию гомеостаза многоклеточного организма и, следовательно, к биомедицинским задачам коррекции этого процесса в случае различных заболеваний. Известно, что запуск программы, ведущей к смерти клетки, может осуществляться как специфическими сигналами (например, цитокинами или гормонами), так и неспецифическими, такими как радиация, повышение температуры или действие окислителей. При действии подобных факторов на клетку, в ней запускается множество сигнальных путей, ведущих к нейтрализации последствий их отрицательного воздействия или, в случае непоправимого ущерба, к гибели клетки. Такая гибель поврежденных клеток происходит по пути программируемой клеточной гибели. В противовес клеточной гибели природе существуют вещества защищающие клетки от действия различных факторов (свободных радикалов) – антиоксиданты. К антиоксидантам относятся многие вещества такие как витамины С, Е и В, ряд аминокислот, флавоноиды.

Целью данной работы было исследование изменения состава липидов мембран эритроцитов крови голубя при действии окислительного стресса и антоцианов смородины и ежевики. В рамках указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. выделить и идентифицировать антоцианы из смородины и ежевики;
2. изучить влияние окислительного стресса на состав липидов клеток эритроцитов голубя;
3. изучить влияние  антоцианов на состав липидов клеток эритроцитов голубя при окислительном стрессе.

 

1  Аналитический обзор

1.1 Общая характеристика и значение различных путей программируемой клеточной гибели 

 

В основу классификации клеточной  гибели могут быть положены морфологические  проявления (апоптотическая, некротическая, аутофагическая и др.), биохимические критерии (с участием или без участия нуклеаз, таких, как каспазы, кальпаины, катепсины и трансглутаминазы), функциональные аспекты (запрограммированная или спонтанная, физиологическая или патологическая), а также иммунологические характеристики (иммуногенная или неиммуногенная) [1].

Апоптоз. Предположительно, апоптоз эволюционно возник у прокариот и закрепился у одноклеточных эукариот, в качестве механизма противовирусной защиты популяций. В дальнейшем, с появлением многоклеточных организмов, механизм программируемой клеточной смерти совершенствовался и был приспособлен, наряду с защитой от патогенов, для реализации важных жизненных функций:  дифференцировки клеток и тканей при эмбриогенезе и постэмбриональном развитии; элиминирования клеток иммунной системы, невостребованных, состарившихся клеток либо клеток, подвергшихся воздействию мутагенных факторов[2].

Морфологическими проявлениями апоптоза являются округление клетки, сокращение ее псевдоподий, снижение объема всей клетки и ее ядра (пикноз), конденсация хроматина, фрагментация ядра, пузырчатость цитолеммы, поглощение клетки резистентными фагоцитами. Изменения ультраструктуры цитоплазматических органелл при этом, как правило, незначительны или отсутствуют; целостность цитоплазмы сохраняется до последних стадий процесса (рисунок 1.1,а). Следовательно, термин «апоптоз» должен быть применим исключительно к таким событиям гибели клеток, которые имеют место при несомненном проявлении нескольких из этих морфологических признаков [3].

 

а – апоптоз опухолевой клетки глиомы головного мозга крысы.×12000; б – некроз клетки K562 (линия эритромиелолейкоза человека).×15000; в – аутофагия с образованием аутофагосомы (АФ) в эпителиоците слизистой оболочки тонкой кишки крысы в зоне слущивания.×60000; г – ороговение кератиноцитов с образованием кератогиалиновых гранул и пластинчатых телец, содержащих липиды (указаны стрелками). ×14000

Рисунок 1.1 - Ультраструктурные проявления основных типов клеточной гибели

 

Биохимическими признаками апоптоза принято считать: активацию

проапоптотических белков семейства Bcl-2,активацию каспаз, изменение проницаемости мембран митохондрий, олигонуклеосомальную фрагментацию ДНК, проявление ФС на внешней стороне цитолеммы, ее разрыв, накопление короткоцепочечной ssДнк [3].

Итак, термин «апоптоз» несет в себе значительную степень биохимической и функциональной гетерогенности. Имеется несколько подтипов апоптоза, которые обладая морфологически сходными признаками, могут запускаться по различным биохимическим путям (например, «внешний» и «внутренний», с участием митохондрий или без, каспазависимый или каспанезависимый и т.д.). Во многих случаях ингибирование каспаз просто вызывает сдвиг морфологической картины гибели клеток с апоптотической к смешанной и даже к резко выраженным формам некроза или аутофагической клеточной смерти.

Некроз. Некротическая клеточная гибель, или некроз, представляет собой морфологически охарактеризованный тип гибели клеток, при котором наблюдается увеличение объема клетки, умеренная конденсация хроматина, набухание органелл с разрывом цитолеммы и последующей утратой внутриклеточного содержимого (рисунок 1.1, б). В течение длительного времени некроз рассматривали как случайную, неконтролируемую форму клеточной смерти, однако к настоящему времени накопились свидетельства того, что некротическая гибель может быть программируемой. Так, показано, что рецепторы домена смерти (например, TNFR1, Fas/CD95,TRAIL-R) и   Toll-подобные рецепторы (например, TLR3 и TLR4) способствует возникновению некроза, в частности в присутствии ингибиторов каспаз или при ингибировании киназы RIP-1 с помощью так называемых некростатинов – небольших пептидных молекул. Некоторые авторы предлагают термин «некроптоз» для обозначения регулируемого (противоположность случайному) некроза [5].

К биохимическим маркерам некроза можно отнести падение  уровня АТФ в клетке, высвобождение  провоспалительного цитокина HMGB-1, увеличение проницаемости митохондриальных и лизосомальных мембран, избыточное образование активных форм кислорода, возрастание концентрации кальция в цитозоле, приводящее к перегрузке митохондрий и активации некаспазных протеаз. В случаях регулируемой некротической смерти клеток показана ведущая роль серин-треониновой киназы RIP-1. До сих пор, однако, не существует единичного мнения о том, какие биохимические критерии могут быть использованы для однозначной идентификации некроза.

Аутофагия. Сегодня в центре внимания специалистов в области клеточной биологии оказался еще один процесс — аутофагия (аутофагоцитоз). Ее подразделяют на макроаутофагию, микроаутофагию и шаперон - ассоциированная аутофагия (CMA) [6].

Морфологически аутофагическая клеточная гибель определяется как тип смерти клетки, происходящей при отсутствии конденсации хроматина, но сопровождающейся массированной аутофагической вакуолизацией цитоплазмы. В противоположность апоптозу клетки, которые погибают с морфологическими признаками аутофагии, не ассоциированы с фагоцитами. Макроаутофагия  характеризуется секвестрацией цитоплазматического материала в аутофагосомы и является более изученным типом аутофагии. Аутофагосомы, по определению, являются двумембранными структурами, которые содержат разрушающиеся цитоплазматические органеллы и/или цитозоль, что позволяет отличить их при помощи трансмиссионной электронной микроскопии от других типов везикул, таких, как эндоспоры, лизосомы или апоптотические пузырьки (рисунок 1.1,в). Аутофагосомы помогают к летке избавляться от хлама — продуктов неправильного соединения обычных белков или белков, выработавших свой ресурс. Такие белки либо перестают функционировать, либо, что гораздо хуже, функционируют неправильно, и от них необходимо как можно скорее избавиться. Непрерывно работающая система аутофагии поддерживает концентрацию таких белков на безопасном уровне [7].

Аутофагосомы не только удаляют аномальные белки, но и отыскивают и изолируют поврежденные органеллы. Так, митохондрии, в норме обеспечивающие клетку энергией, могут посылать ей несвоевременные сигналы к запрограммированной гибели — апоптозу [8].

Не так хорошо изученным  является следующий тип аутофагии - микроаутофагия. При микроаутофагии, как при образовании мультивезикулярных телец, образуются впячивания мембраны эндосомы или лизосомы, которые затем отделяются в виде внутренних пузырьков, только в них попадают вещества, синтезированные в самой клетке. Таким путем клетка может переваривать белки при нехватке энергии или строительного материала (например, при голодании). Но процессы микроаутофагии происходят и при нормальных условиях и в целом не избирательны. Иногда в ходе микроаутофагии перевариваются и органоиды; так, у дрожжей описана микроаутофагия пероксидом водорода  и частичная микроаутофагия ядер, при которой клетка сохраняет жизнеспособность. Этот механизм также является путём деградации органелл и долгоживущих белков, но, в отличие от макроаутофагии, он не отвечает за адаптацию к недостатку питательных веществ[10].  
         Третий тип самопоедания является  шаперон -ассоциированная аутофагия (CMA) (рисунок 1.2). Несмотря на то, что этот путь также чувствителен к недостатку питательных веществ, в нём не происходит тотального поглощения органелл или избирательного распознавания субстрата. В CMA, белки цитоплазмы, которые содержат конкретные пента-пептидные мотивы, распознаваемые лизосомами (консенсус последовательность KFERQ) распознаются комплексом белков-шаперонов (в том числе теплового шока 73 кДа-белок, hsc73) и направляются к лизосомной мембране, где они взаимодействуют с белками, связанными с мембраной лизосом (LAMP). Пока еще не ясно как KFERQ мотив распознается шапероновым комплексом. Некоторые посттрансляционные изменения субстратов (например, окисление или денатурация) могут сделать этот мотив более доступными для шаперонов, повышая уровень их лизосомного поглощения в CMA [11].