Изменение фосфолипидного состава мембран

 

2  Материалы  и методы исследования

2.1 Объект исследования

 

Объектом исследования служили  антоцианы, выделенные из черной смородины (Ribеs nigrum), ежевики (Rubus) и эритроциты крови голубя (Columba livia).

Для исследования использовали кровь, стабилизированную гепарином. Инкубацию крови проводили в  пластиковых пробирках следующим  образом: помещали в пробирки по 3 мл стабилизированной крови, приливали  водный раствор цианистого калия  до концентрации 10 мМ, перикисное окисление липидов индуцировали препаратом «нитропруссид натрия»  до концентрации 20 мМ, ингибировали  ПОЛ добавлением 30% водно – спиртового раствора выделенных флавоноидов до концентрации 0,0025мг/мл.   Пробирки помещали в термостат при температуре 25⁰С при постоянном перемешивании. Отбор аликвот крови проводили через 12 и  24 часа после воздействия индуктора и ингибитора.

 

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение флавоноидов

 

Для выделения флавоноидов  использовали плоды чёрной смородины. 5 г измельчённых плодов помещали в колбу и заливали  50 мл 70% этилового спирта. Экстракцию проводили на водяной бане с обратным холодильником двукратно по 45 минут. Полученные экстракты объединяли [29]. 

Кумарины, мешающие количественному  определению флавоноидов, извлекали  из водно–спиртовой фракции хлороформом [30]. Для этого к 5 мл водно-спиртового раствора приливали 2,5 мл хлороформа и центрифугировали 15 минут при 3000 оборотах. Происходило разделение раствора на две фракции: верхнюю – кумарины и хлороформ и нижнюю – водно-спиртовой раствор флавоноидов. Нижнюю часть отбирали и выпаривали на водяной бане до постоянного веса. Полученные флавоноиды растворяли в 70% этиловом спирте до концентрации 40 мг/мл.

 

2.2.2 Разделение флавоноидов методом ТСХ

 

Для разделения флавоноидов  использовали хроматографическую камеру. Стенки камеры выстилали изнутри фильтровальной бумагой, которая пропитывается растворителем, чтобы ускорить ее насыщение парами системы растворителей.

Использовали систему  растворителей  Х:М (хлороформ – метанол) 8:3[31]. камеру готовили по крайней мере, за 1 час до проведения хроматографии, для этого в нее заливали достаточное количество растворителя, толщина слоя системы растворителей составляла около 1-1,5 см. Обязательным условием хроматографирования является герметичность камеры. В одну камеру одновременно помещали не более двух пластинок, причем так, чтобы поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бумаги, а слои адсорбента находились на максимальном удалении друг от друга. Образцы, предназначенные для разделения, наносим на расстоянии 0,5 – 1,5 см от краев пластины. Образцы наносили микрошприцем фирмы «Hamilton» (США)  по 30 мкл в виде полосы (одномерное разделение) на алюминиевые пластинки «Silufol» с тонким слоем силикагеля. В качестве свидетеля использовали 1% раствор свидетеля.

После полного испарения  растворителя из нанесенных образцов, пластины помещали в хроматографическую камеру. Разделение заканчивали, когда фронт растворителей не доходил до верхнего края пластинки на 0,5 см. Пластинку вынимали из камеры и высушивали в токе холодного воздуха до исчезновения запаха растворителей.

 

 

2.2.3 Микроскопия

 

Для приготовления мазков на чистое предметное стекло наносят  небольшой каплей кровь из пробирки. При помощи стекла с отшлифованным  краем готовят мазок. Окраску  проводят Эозином метиленовой сини по Май - Грюнвальду. краситель Эозина метиленовой сини по Май – Грюнвальду представляет собой 0,25% раствор сухого красителя, являющегося смесью азура с метиленовым голубым в соотношении 1:5 в метаноле. Его наливают на нефиксированный препарат так, чтобы он покрыл весь мазок крови и через 2 – 3 минуты добавляют при тщательном перемешивании двойное количество фосфатно-буферного раствора. Буфер готовят следующим образом: на аналитических весах взвесить навеску 17,838 г. натрия фосфорнокислого двузамёщенного и растворить  1000 мл дистиллированной воды. На аналитических весах взвесить навеску 13,614 г. калия фосфорнокислого однозамещенного и растворить 1000 мл дистиллированной воды. К 100 мл дистиллированной воды прилить 0,5 мл натрия фосфорнокислого двузамещённого и 0,5 мл калия фосфорнокислого однозамещенного. pH полученного раствора должен быть 6,8 – 7,0.

После добавления фосфатно-буферного  раствора препарат окрашивают 5 - 10 минут. После окраски препарат промыть  дистиллированной водой, высушить на воздухе  и микроскопировать.

 

2.2.4 Выделение общих липидов по методу Блайя-Дайера

 

Для получения эритроцитарной массы эритроциты трижды промывали физиологическим раствором с последующим центрифугированием в течение 15 мин. при 3000 об/мин.

Готовили гомогенизат, состоящий из хлороформа, метанола и воды (1:2:0,8 по объему) и добавляли его к 0,5 мл эритроцитарной массы, оставляли на экстракцию в течении 1 часа. Для разделения нелипидных водорастворимых примесей в полученную смесь добавляли ¼ мл хлороформа и ¼ мл воды от общего объема, вытряхивали и оставляли на 10 – 12 часов или центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин. В этих условиях происходит деление раствора на 2 фазы: верхняя-водно-метанольная, содержит водорастворимые компоненты, на границе фаз – белая пленка – протеолипиды, и нижняя – хлороформная, содержит липиды. Нижнюю фазу осторожно отделяли и сливали в предварительно взвешенную выпаривательную колбу.

Конечный экстракт в выпаривательной колбе упаривали на роторном испарителе «ROTADEST» (Венгрия), затем высушивали в токе охлажденного азота до постоянного веса. Полученные липиды растворяли в смеси хлороформ- метанол (2:1 по объему) до концентрации 20 мг/мл.

 

2.2.5 Тонкослойная хроматография липидов

 

Тонкослойную  хроматографию (ТСХ) проводили в  тонком слое силикагеля, нанесенного  на стеклянную пластинку. Применяли  силикагель марки КСК (Вознесенск). В качестве связующего  компонента использовали гипс.

Для приготовления  ТСХ пластин стеклянную подложку  промывали хромовой смесью, водой, а  затем дистиллированной водой.  Готовили навеску силикагеля 10 г, добавляли 1 г гипса растворяли ее в 33 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию перемешивали на магнитной мешалке в течение 20 минут. Далее ее наносили на установленную по уровню пластинку и оставляли до застывания.

Для двумерного разделения липидов хроматографию  проводили в системах Брокхьюза: хлороформ : метанол : аммиак : вода (9 : 5,4 : 0,5 : 0,8) – первое направление, хлороформ : метанол : ледяная уксусная кислота : вода (9:4:1:0,4) – второе направление. Разделение проводили в хроматографических камерах. Стенки их выстилали изнутри фильтровальной бумагой, которая пропитывается растворителем, чтобы ускорить ее насыщение парами системы растворителей. Если атмосфера внутри камеры была ненасыщенна, то растворитель испарялся из слоя адсорбента в процессе восходящей хроматографии. В этом случае наблюдалось ухудшение результатов разделения. Систему растворителей в камере готовили, по крайней мере, за 30 минут до проведения хроматографии, для этого в нее заливали достаточное количество растворителя. Обязательным условием хроматографирования является герметичность камеры. В одну камеру одновременно помещали не более двух пластинок, причем так, чтобы поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бумаги, а слои адсорбента находились на максимальном удалении друг от друга. Для хорошего разделения липидов, особенно при повышенной влажности и температуре хроматографические пластинки прогревали в течение 30 минут при температуре 110 – 120^о С. После охлаждения пластин, образцы, предназначенные для разделения, наносили на расстоянии 0,5 – 0,7 см от краев пластины. Образцы наносили микрошприцем фирмы «Hamilton» (США) в виде пятна при двумерном делении или полосы при одномерном.

После полного  испарения растворителя из нанесенных образцов, пластины помещали в хроматографические камеры. Разделение заканчивали, когда фронт растворителей не доходил до верхнего края пластины на 0,5 см. Пластину вынимали из камеры, высушивали до исчезновения запаха растворителей и помещали во вторую систему.

Для обнаружения  липидов использовали метод, основанный на окрашивании их парами йода, он удобен благодаря своей быстроте, универсальности  и отсутствию разрушающего действия на липиды. Пластины после извлечения из хроматографической камеры высушивали и помещали в эксикатор, содержащий кристаллы йода. Липиды обнаруживаются в виде коричнево-желтых пятен или полос. Пятна осторожно очерчивали мягким карандашом и ждали, чтобы йод улетучился. Процесс иногда ускоряли нагреванием пластины.

Для обнаружения  индивидуальных фосфолипидов пластины после проведения ТСХ высушивали, затем проявляли раствором 10 % серной кислоты в метаноле и сжигали в сушильном шкафу при температуре 110^о С.

 

2.2.6 Количественное определение фосфолипидов

 

Для определения  количества индивидуальных фосфолипидов соскабливали с пластинки пятно каждого фосфолипида в стеклянную пробирку. Затем добавляли в каждую пробирку по 0,05 мл 72% хлорной кислоты. Помещали пробирки в дюралевый блок и сжигали при температуре 180-190 єC в течение 50 минут. Давали пробам остыть, и добавляли по 0,45 мл универсального реагента Васьковского (реагент В).

Сначала получали исходный реагент A. К 10 г Na молибденовокислого в 60 мл 4н HCl добавляли 0,4 г солянокислого гидразина в 14 мл 4н HCl. Смесь нагревали на водяной бане в течение 20 минут, охлаждали, добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Используемый для количественного определения фосфолипидов реагент B  готовили, добавляя к 4 мл исходного реагента A 26 мл 1н серной кислоты. Доводили объем до 100 мл дистиллированной водой.

Пробы с реагентом  B тщательно перемешивали на резиновом блоке шейкера, после чего пробирки помещали в кипящую водяную баню на 15 минут. Затем пробы центрифугировали в течение 10 минут при 2500 оборотах в минуту. После чего определяли оптическую плотность растворов при длине волны 815 нм на спектрофотометре UV mini - 1240. Количество фосфолипидов (в мкг), содержащееся в сожженном образце, определяли с помощью калибровочной кривой непосредственно по результатам измерений оптической плотности.

Для определения  количества фосфора в суммарном  липидном экстракте отбирали квоту  липидного раствора с известной  концентрацией, испаряли растворитель. Используя стандартный раствор КН₂РО₄, добавляли его в пробирки в определенных количествах до содержания фосфата в них в интервале от 0 до 1,0 мкг. Строили калибровочную кривую. При определении содержания фосфора стандартные образцы сжигали без центрифугирования[32].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 Результаты и их обсуждение

3.1 Изменение фосфолипидного состава мембран эритроцитов под действием нитропруссида натрия и антоцианов смородины

 

Формы запрограммированной  клеточной гибели широко исследуются  на современном этапе. Эти процессы играют очень важную роль в формировании и  функционировании многоклеточных организмов, поэтому не перестают  интересовать ученых во всем мире [33]. На сегодняшний момент активно рассматриваются различные факторы, приводящие к индукции или предотвращению процессов клеточной гибели. В последние годы наибольший интерес вызывают процессы, происходящие в клетке под действием оксида азота [34]. Это вещество вызывает изменение многих характеристик клеточных мембран: плотность, жесткость, проницаемость, фазовое состояние и др.  Все эти характеристики определяются липидным составом клеточных мембран. Поэтому исследуя изменение фосфолипидного состава мембраны, можно понять процессы, которые происходят в клетке под действием оксида азота (индуктора программируемой гибели) и флавоноидов, которые предотвращают процессы перекисного окисления липидов. Для изучения влияния  оксида азота  был взят нитропруссид натрия, который широко применяется в научных исследованиях как донор NO [35].

Объектом исследования служили  антоцианы, выделенные из черной смородины (Ribеs nigrum) и эритроциты крови голубя (Columba livia).

Для исследования использовали кровь, стабилизированную гепарином. Инкубацию крови проводили в пластиковых пробирках следующим образом: помещали в пробирки по 3 мл стабилизированной крови, приливали водный раствор цианистого калия до концентрации 10 мМ, перикисное окисление липидов индуцировали препаратом «нитропруссид натрия» до концентрации 20 мМ, ингибировали  ПОЛ добавлением 30% водно – спиртового раствора выделенных антоцианов смородины до концентрации 0,0025мг/мл. Пробирки помещали в термостат при температуре 25⁰С при постоянном перемешивании. Отбор аликвот крови проводили через 12 и 24 часа после воздействия индуктора и ингибитора.

После выделения индивидуальных фосфолипидов определяли оптическую плотность полученных проб растворов при длине волны 815 нм на спектрофотометре UV mini - 1240.

 Количество фосфолипидов (в мкг), содержащееся в сожженном образце, определяли с помощью калибровочной кривой непосредственно по результатам измерений оптической плотности.

Полученные данные были занесены в таблицу 3.1 и на их основании было показано изменение содержания отдельных фосфолипидов после инкубации при 25⁰С   (рисунок 3.1).

Проба	Контроль	250С с НП 12 ч	250С с НП и   Ан см 12 ч	250С с НП 24 ч	250С с НП и Ан см 24 ч
ФЭА	0,92	0,53	0,64	0,49	0,67
ФХ	1,12	1,32	0,85	1,35	1,16
ФС + ФИ	0,63	0,50	0,56	0,42	0,55
ЛФХ	0,30	0,37	0,24	0,35	0,26
СМ	0,69	1,13	0,78	1,49	0,92

 

Таблица 3.1 – Изменение количества фосфолипидов при инкубации в

течении 12 ч и 24ч при 25°С