Изменение фосфолипидного состава мембран

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 3. 1 - Изменение количества фосфолипидов при инкубации с антоцианами смородины в течение 12 ч и 24 ч при 25⁰С

 

 

В норме в мембранах  эритроцитов содержится ФЭА – 0,830 мкг Р/мг общих липидов, ФС+ФИ – 0,700 мкг Р/мг общих липидов, ФХ – 1,000 мкг Р/мг общих липидов, ЛФХ – 0,270 мкг Р/мг общих липидов, СМ – 0,910 мкг Р/мг общих липидов.

При инкубировании с добавлением источника оксида азота – нитропруссида натрия в течение 12 ч при 25°С в мембранах эритроцитов содержится  ФЭА – 0,53 мкг Р/мг общих липидов, ФС+ФИ – 0,50 мкг Р/мг общих липидов, ФХ – 1,32 мкг Р/мг общих липидов, ЛФХ – 0,37 мкг Р/мг общих липидов, СМ – 1,13 мкг Р/мг общих липидов.

Под действием нитропруссида натрия при 25⁰ С 12 часах происходило уменьшение доли легко окисляемых фракций фосфолипидов – ФЭА на 36,2%, ФС+ФИ на 28,6%, и увеличение доли трудно окисляемых фракций – ФХ на 49%, СМ на 24,2%, ЛФХ  на 37% по сравнению с контролем.

Таким образом, при выдерживании исследуемых проб с нитропруссидом натрия при 25⁰С в течение 12 ч происходит уменьшение количества легко окисляемых фракций фосфолипидов и увеличение количества трудно окисляемых фракций, что может быть вызвано процессами ПОЛ, которые усиливает оксид азота.

При проведении опыта с добавлением источника оксида азота – нитропруссида натрия в течение 24 ч при 25⁰С в мембранах эритроцитов содержится  ФЭА – 0,49 мкг Р/мг общих липидов, ФС+ФИ – 0,42 мкг Р/мг общих липидов, ФХ – 1,35 мкг Р/мг общих липидов, ЛФХ – 0,35 мкг Р/мг общих липидов, СМ – 1,49 мкг Р/мг общих липидов.

Увеличение времени до 24 часов при 25⁰С приводит к следующим изменениям фосфолипидного состава мембран эритроцитов: под действием оксида азота доля ФЭА уменьшается на 41 %, ФС+ФИ на 40%, а доля ФХ, ЛФХ и СМ увеличивается на 35%, 29,6% и 63,7% по сравнению с контролем.

В тех же условиях в течение 24 ч количество легко окисляемых фракций продолжает уменьшаться, а трудно окисляемых – увеличиваться, но уже в меньшей степени по сравнению с первыми 12 ч инкубации. Это может быть объяснено тем, что основная часть процессов произошла в первые 12 ч и далее изменений не происходило.

С добавлением источника оксида азота – нитропруссида натрия и антоцианов смородины в течение 12 ч при 25⁰С в мембранах эритроцитов содержится  ФЭА – 0,64 мкг Р/мг общих липидов, ФС+ФИ – 0,56 мкг Р/мг общих липидов, ФХ – 0,85 мкг Р/мг общих липидов, ЛФХ – 0,24 мкг Р/мг общих липидов, СМ – 0,78 мкг Р/мг общих липидов.

Введение  антоцианов смородины  при 25⁰ С и инкубации 12 ч вызывает увеличение ФЭА на 20,7%, ФС+ФИ на 33,3%, и уменьшение ФХ на 35,7%, ЛФХ на 35,2% и СМ на 31% относительно проб с нитропруссидом натрия.

Добавление к инкубируемой смеси антоцианов смородины вызвало увеличение количества легко окисляемых липидов и уменьшение количества трудно окисляемой фракции, что подтверждает антиоксидантные свойства антоцианов.

При увеличении времени опыта до 24 ч при 25⁰С в мембранах эритроцитов содержалось  ФЭА – 0,67 мкг Р/мг общих липидов, ФС+ФИ – 0,55 мкг Р/мг общих липидов, ФХ – 1,16 мкг Р/мг общих липидов, ЛФХ – 0,26 мкг Р/мг общих липидов, СМ – 0,92 мкг Р/мг общих липидов.

Введение антоцианов смородины при 25⁰С и инкубации 24 ч вызывает увеличение ФЭА на 36,7%, ФС+ФИ на 30,9%, и уменьшение ФХ на 10,5%, ЛФХ на 25,8%, СМ на 38,3 % относительно проб с оксидом азота.

Таким образом, при увеличении срока инкубирования образцов  до 24 ч в тех же условиях, содержание легко окисляемых липидов продолжало увеличиваться, а трудно окисляемых - уменьшаться. Это говорит о продолжительности действия антиоксидантных свойств антоцианов смородины.

 

3.2  Изменение  фосфолипидного состава мембран  эритроцитов под действием нитропруссида натрия и антоцианов ежевики

 

Ягодный кустарник ежевика, выращиваемая во многих странах ради своих целебных плодов, содержат в листьях богатый комплекс биологически активных веществ. Известно, что в ягодах ежевики лейкоантоцианидины, антоцианы: моно- и диглюкозиды пеларгонидина, 3-глюкозид цианидина, 3-рутинозид цианидина. Установлена гиполипидемическая, гепатозащитная и желчегонная активность фитокомплексов, полученных из ягод ежевики.

Для исследования использовали кровь, стабилизированную гепарином. Инкубацию крови проводили в пластиковых пробирках следующим образом: помещали в пробирки по 3 мл стабилизированной крови, приливали водный раствор цианистого калия до концентрации 10 мМ, перикисное окисление липидов индуцировали препаратом «нитропруссид натрия» до концентрации 20 мМ, ингибировали  ПОЛ добавлением 30% водно – спиртового раствора выделенных антоцианов ежевики до концентрации 0,0025мг/мл. Пробирки помещали в термостат при температуре 25⁰С при постоянном перемешивании. Отбор аликвот крови проводили через 12 и 24 часа после воздействия индуктора и ингибитора.

Полученные данные были занесены в таблицу 3.2 и на их основании было показано изменение содержания отдельных фосфолипидов после инкубации при 25⁰С (рисунок 3.2).

 

Таблица 3.2 – Изменение количества фосфолипидов при инкубации в

течении 12 ч и 24ч при 25°С

 

Проба	Контроль	250С с НП 12 ч	250С с НП и   Ан еж 12 ч	250С с НП 24 ч	250С с НП и  Ан еж 24 ч
ФЭА	0,92	0,53	0,57	0,49	0,56
ФХ	1,12	1,32	0,89	1,35	1,24
ФС + ФИ	0,63	0,50	0,52	0,42	0,47
ЛФХ	0,30	0,37	0,32	0,35	0,31
СМ	0,69	1,13	0,85	1,49	0,97

 

 

Рисунок 3. 2 - Изменение количества фосфолипидов при инкубации с антоцианами ежевики в течение 12 ч и 24 ч при 25⁰С

В мембранах эритроцитов в нормальном состаянии содержится ФЭА – 0,830 мкг Р/мг общих липидов, ФС+ФИ – 0,700 мкг Р/мг общих липидов, ФХ – 1,000 мкг Р/мг общих липидов, ЛФХ – 0,270 мкг Р/мг общих липидов, СМ – 0,910 мкг Р/мг общих липидов.

С добавлением источника оксида азота – нитропруссида натрия и антоцианов ежевики в течение 12 ч при 25⁰С в мембранах эритроцитов содержится  ФЭА – 0,57мкг Р/мг общих липидов, ФС+ФИ – 0,52 мкг Р/мг общих липидов, ФХ – 0,89 мкг Р/мг общих липидов, ЛФХ – 0,32 мкг Р/мг общих липидов, СМ – 0,85 мкг Р/мг общих липидов.

Введение  антоцианов ежевики  при 25⁰ С и инкубации 12 ч вызывает увеличение ФЭА на 7,5%, ФС+ФИ на 4%, и уменьшение ФХ на 32,6%, ЛФХ на 13,6% и СМ на 24,8% относительно проб с нитропруссидом натрия.

Добавление к инкубируемой смеси антоцианов ежевики вызвало увеличение количества легко окисляемых липидов и уменьшение количества трудно окисляемой фракции, что подтверждает антиоксидантные свойства антоцианов.

При увеличении времени опыта до 24 ч при 25⁰С в мембранах эритроцитов содержалось ФЭА – 0,56 мкг Р/мг общих липидов, ФС+ФИ – 0,47 мкг Р/мг общих липидов, ФХ – 1,24 мкг Р/мг общих липидов, ЛФХ – 0,31 мкг Р/мг общих липидов, СМ – 0,97 мкг Р/мг общих липидов.

Введение антоцианов смородины при 25⁰С и инкубации 24 ч вызывает увеличение ФЭА на 14,2%, ФС+ФИ на 11,9%, и уменьшение ФХ на 8,2%, ЛФХ на 11,5%, СМ на 34,9 % относительно проб с оксидом азота.

При увеличении срока инкубирования образцов  до 24 ч в тех же условиях, содержание легко окисляемых липидов продолжало увеличиваться, а трудно окисляемых - уменьшаться. Это говорит о продолжительности действия антиоксидантных свойств антоцианов ежевики.

 

 

 

Выводы

 

1. При исследовании изменения фосфолипидного состава мембран эритроцитов голубя, инкубированных при 25⁰С с нитропурссидом натрия показано, что происходит уменьшение количества легко окисляемых фракций: ФЭА, ФС+ФИ по сравнению с контрольным образцом. Количество трудно окисляемых фракций (ФХ и СМ) при данных условиях по сравнению с контрольным образцом увеличилось. Данные изменения свидетельствуют о том, что нитропурсит натрия запускает процессы перекисного окисления липидов мембраны.

2. При увеличении продолжительности выдерживания исследуемых образцов с 12 ч до 24 ч в тех же условиях, изменение количества легко окисляемых и трудно окисляемых фракций происходит в меньшей степени. Следовательно, основная часть процессов ПОЛ протекает впервые 12 ч.

 3. При добавлении к опытным образцам антоцианов черной смородины и ежевики наблюдается подъем легко окисляемых фракций и спад трудно окисляемых фосфолипидов относительно проб с нитропурсидом натрия. Данные изменения наблюдаются и при увеличении инкубирования образцов до 24 ч, что говорит о сохранении антиоксидантного действия антоцианов на организм на указанный срок.

4. Увеличение количества легко окисляемых фракций на 42% и уменьшение количества трудно окисляемых фосфолипидов на 31% наблюдается при добавлении антоцианов смородины. Полученные измерения говорят о более сильном антиоксидантном действии антоцианов смородины по сравнению с антоцианами ежевики.

 

 

 

 

 

Список использованных источников

 

1  Антонова Е. И.   Пути   программируемой гибели клеток /               Е. И. Антонова, О. З. Мкртчан // Биология в школе. – 2011. - №3. – С. 3-13.

2  Черников В. П. Морфологические и биохимические критерии гибели клеток / В. П. Черников, Т. А. Белоусова, Л. В. Кактурский // Архив патологии. – 2010. - №3. – С.48-54

3   Варга О. Ю. Апоптоз: понятие, механизмы реализации, значение / О.Ю. Варга, В. А. Рябов//    Экология человека. – 2006. - №7 – С. 28-32

4  Анисимов В. Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения — 2-ое издание, переработанное и дополненное./ В. Н. Анисимов. - СПб.: Наука, 2008. — 434 с.

5   Барышников А. Ю.    Иммунологические     проблемы    апоптоза                /    А. Ю. Барышников,    Ю. В. Шишкин. — М.: Эдиториал УРСС, 2002. — 320 с.

6  Ванюшин Б. Ф. Апоптоз у растений / Б. Ф. Ванюшкин // Успехи биологической химии. — 2001. — Т. 41. — С. 3—38.

7   Гордеева А. В. Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция / А. В. Гордеева, Ю. А. Лабас, Р. А. Звягильская // Биохимия. — 2004. — №. 10. — Т. 69. — С. 1301—1313.

8   Кузнецов С. Л. Гистология, цитология и эмбриология: Учебник  для медицинских   вузов / С. Л. Кузнецов, Н. Н. Мушкамбаров. —          М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. — 600 с.

9   Манских В. Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение / В. Н. Манских // Цитология. — 2007. — Т. 49. — № 11. — С. 909-915.

10   Ярилин А. А.    Апоптоз и его    роль в целостном    организме /             А. А. Ярилин // Глаукома. — 2003. — №. 2. — С. 46—54.

11  Проскуряков С. Я. Некроз – активная форма программируемой клеточной гибели / С. Я. Проскуряков // Биохимия. – 2002. – Т.67. – №.4. – С.467 - 491

12  Самуилов В. Д. Программируемая клеточная смерть                             / В. Д. Самуилов,  А. В. Олексин,  Е. М. Лагунова  // Биохимия. – 2000. – Т.65. -  №8. – С. 1029 – 1946

13 Negoescu A. Importance of DNA fragmentation in apoptosis with regard to TUNEL specificity./ A. Negoescu, C. Guillermet, P. Lorimier// Biomed-Pharmacother.- 1998.- Vol.52, №6.- Р. 252-258

14 Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide./ H. Steller// Science.- 1995.-Vol 26, №7.- 1445-1449

15 Lash G. The effects of angiogenic growth factors on extravillous trophoblast invasion and motility. / G. Lash, J. E. Cartwright// J Glaucoma.- 2000.-Vol. 20, №8.- P. 661-667

16 Macaya A. Apoptosis in the nervous system./ A. Macaya// Rev-Neurol.- 2000.- Vol 135, № 24.-Р. 1356-1360

17 Schapira A.H. Mitochondrial disorders/ A.H. Schapira // Curr-Opin-Neurol.- 2001 Feb.- Vol 10, №1.- P. 43-47

18 Solomon H. Nitric Oxide: First in a New Class of Neurotransmitters? / 

H. Solomon // Science.- 2000.- Vol. 25, №7.- P. 494-496

19 Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих /        В.П. Реутов // Усп. биол. наук. – 1995.-Т. 35. - С. 189-228

20 Волков В.В. Глаукома при псевдонормальном давлении /              В.В. Волков // Руководство для врачей.- М., 2001.- С.350

21 Самуилов В.Д. Программируемая клеточная гибель у растений/

В.Д. Самуилов, А.В. Олексин, Е.М. Лагунова // Биохимия.- 2006. - Т.71, №10.- С. 1383-1391

22 Зоров Д. Б. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота / Д. Б. Зоров, С. Ю. Банникова, В.В Белоусов // Биохимия.- 2005. - Т. 70. - № 2. - С. 265–272

23 Зозуля Ю.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга / Ю.А. Зозуля, В.А. Барабой,           Д.А. Сутковой. — М.: Знание-М., 2000. — 344 с.

24 Курашвили В.А. Новые возможности предотвращения оксидативного стресса / В.А. Курашвили // Журнал натуральной медицины. — 2001. — № 1. — С. 7-14

25  Haupt S. Apoptosis – the p53 network / S. Haupt, M. Berger,                Z. Goldberg // Journal of Cell Shience. – 2003. - № 116. – P. 2481 -2495

26 Ботиров Э. Х. Химическое исследование флавоноидов лекарственных и пищевых растений / Э. Х. Ботиров, А. А. Дренин // Химия растительного сырья. – 2006. - №4. – С. 45 – 48

27  Shtil A. A. Redundancy of biological regulation as the basis for emergence of multidrug    resistance / A. A. Shtil, J. Azare //  International Review of Cytology. – 2005. - № 246. – P. 1-29

28   Evstigneeeva R. P. Carboranylporphyrins for boron neutron capture therapy of cancer / R. P. Evstigneeeva, A. V. Zaitsev, V. N. Luzgina,                    V. A. Ol’shevskaya, A. A. Shtil // Current Medicinal Chemistry – Anticancer Agents. – 2003. - № 3. – P. 383-392.

29 Краснов В. А. Активированные кислородные метаболиты при туберкулезе / В.А. Краснов, Н.К. Зенков, А.Р. Колпаков, Е.Б. Меныцикова // Пробл. туб.. - 2005. – № 9. - С. 3-9

30 Колосов Ю.А. Экспериментальная оценка фармакологической активности новых доноров оксида азота [Электронный ресурс] /                Ю.А. Колосов, А.Г. Муляр, М.Т. Гасанов, А.В. Кириллова, А.Л. Верткин // Нижегородский медицинский журнал / Электрон. журнал. - 2006. – Т.28,  №8. – Режим доступа: www.cardiology-congress.ru/files/catalog_thesis. - Загл. с экрана

31  Реутов В.П. Медико - биодогические аспекты циклов оксида азота и супероксидного аноин-радикала. / Реутов В.П. // Вестник РАМН.- 2000.-№4.- С. 30-34

32 Vaskovsky V.E., Kostetsky E.V., Vasendin J. A universal reagent for phospholipid analysis. / V.E. Vaskovsky, E.V. Kostetsky, J. Vasendin //                J. Chromatogr. - 1975. - V. 144. - P. 129-141