Курсовая по микробиологии

     Питательные среды применяют различной консистенции: жидкие, плотные, полужидкие. Плотные  питательные среды используют для  учета количества бактерий, выделения  их в чистую культуру и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя 1,5-2,5% агар-агара или 10-15% желатины. При приготовлении полужидких сред вносят агар-агар в количестве 0,1-0,2%.

     Основными этапами приготовления питательных  сред являются:

     - расчет количества ингредиентов  в соответствии с выбранным  объемом среды;

     - взвешивание ингредиентов и их  растворение в воде;

     - определение и коррекция рН среды;

     - распределение среды по емкостям, в которых будет осуществляться  стерили-зация;

     - укупорка и маркировка емкостей  со средой.

     В данном курсовом проекте для культивирования  чистых культур микроорганизмов  используется питательный агар (ПА), как питательная среда.

     ПА  готовят из коммерческого препарата  «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой», который содержит панкреатический гидролизат  кильки, хлорид натрия и агар-агар. Обычно для приготовления плотной среды требуется вносить в среду дополнительное количество агар-агара. Поскольку эта среда содержит агар-агар, который растворяется в воде только при температуре выше 98ºС, навески порошка вносят во флаконы, заливают нужным объемом воды и стерилизуют автоклавированием при 1атм 20-30мин. Агар-агар - растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным содержанием азотистых веществ. Эта питательная среда относится к плотным питательным средам.

     Для культивирования микроорганизмов  в лаборатории или на производстве необходимо обеспечить их питательными веществами, которые содержаться  в питательных средах. Для подбора  питательных сред необходимо знать  химический состав и тип питания  микроорганизмов, его метаболические особенности, отношение к факторам окружающей среды и др. Ситуация усугубляется тем, что микроорганизмы значительно различаются питательными потребностями, а универсальных  питательных сред, удовлетворяющих  росту всех микроорганизмов или  даже их крупных групп, не существует.

     Тем не менее определенные закономерности составления питательных сред для выделяемых из природных экологических ниш микроорганизмов существуют, также известно большое количество составов питательных сред для самых разных групп микроорганизмов.

     Чаще  всего на практике используют следующие  питательные среды:

     1.Физиологический  раствор (ФР). 8,5 г хлористого натрия растворяют в 1л дистиллированной воды. Стерилизуют при 0,15 МПа в течении 20 минут.

     2. Среда Кеслер. 16 г сухой среды Кеслер растворяют в 1 л дистиллированной воды. Смесь перемешивают и кипятят при перемешивании 25 мин. Объем доводят дистиллированной водой до 1л и фильтруют через вату.

     3. Среда Энда. 5 г сухой среды помещают в колбу со 100 мл дистиллированной среды и перемешивают. Кипятят до полного растворения агара. Фильтруют и снова доводят до кипения. Охлаждают и разливают в чашки Петри.

     4. Питательный бульон (ПБ). Готовят  из гидролизата рыбного концентрированного. Для приготовления 1 л ПБ 40 г пасты растворяют в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения, после охлаждения фильтруют.

     5. Сусло – агар (СА). Неохмеленное солодовое сусло разводят дистиллированной водой. К 1 л разбавленного сусла добавляют 20 г агар – агара. Среду расплавляют на водяной бане и фильтруют. Затем стерилизуют при 0,12 МПа в течении 20 минут.   

     2.2.2 Выделение чистых культур бактерий и грибов

     В биотехнологических производствах в качестве одного из видов исходных материалов используют чистую культуру микроорганизмов.

     Чистой  культурой (ЧК) называют популяцию, представляющую собой потомство одной или нескольких клеток одного вида микроорганизмов. В генетических исследованиях пользуются клонами – чистыми культурами, полученными от одной споры или гаплоидной клетки.

     В естественных условиях различные объекты  содержат, как правило, смешанную  микрофлору. Для диагностических  исследований с целью выяснения  возбудителей порчи пищевых продуктов  или их обсемененности микроорганизмами требуется выделение чистой культуры. Методы выделения ЧК могут быть прямыми и косвенными. Прямые – основаны на выделении под непосредственным контролем через микроскоп, например метод Линднера. Известны методы извлечения одной клетки из взвеси микроорганизмов с помощью специальных приборов (микроманипулятор, микроселектор Перфильева) под контролем микроскопа. Однако наиболее распространенным способом выделения чистых культур являются косвенные методы выделения чистой культуры микроорганизмов, основанные на изоляции одной микробной клетки от массы микроорганизмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов.

     Для посева чаще используются агаризованные среды в чашках Петри. Этот метод предложен известным немецким микробиологом Кохом и носит название метода пластинчатых (или чашечных) культур Коха.

     Основной  задачей метода является разведение концентрации микроорганизмов в  исследуемом материале с таким  расчетом, чтобы при посеве его  на питательной среде выросли  изолированные колонии. Существуют два основных метода разведения исследуемого материала:

     1) на поверхности плотной питательной  среды «методом истощающего посева»;

     2) предварительное разведение материала  в физиологическом растворе или  стерильной водопроводной воде  в пробирках и высев готового  разведения на плотную питательную  среду.

     Метод истощающего посева на поверхности плотной среды используется для выделения чистых культур аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов. С этой целью для посева берут ряд чашек Петри с плотной средой; в первую чашку наносят исследуемый материал и распределяют его по поверхности шпателем Дригальского или бактериологической петлей.

     Подготовка  чашек Петри с плотной средой. Стерильную плотную среду плавят в водяной бане (агаризованную – при температуре кипения воды) или микроволновой печи, слегка остужают и разливают в чашки Петри по 15-20 ммл.) Накрывают чашки стерильными бумажными фильтрами и подсушивают прни комнатной температуре в течении 30-40 мин. Затем фильтры снимают и закрывают донышки со средой стеклянными крышками. Подсушить агаризованную среду можно также в термостате или сушильном шкафу ( 40-60 С), если оставить их открытыми (поверхность среды должна быть обращена вниз на 15-20 мин.)

     Затем, не стерилизуя шпатель (или петлю), производят посев последовательно на поверхность среды в остальных чашках. Количество материала, внесенного в среду, при этом последовательно убывает (истощающий посев).

     После посева чашки Петри помещают в  термостат вверх донышками (ставят на крышки), чтобы конденсат, образующийся на крышках в процессе инкубирования не попадал на поверхность среды и не размывал посевы.

     Метод предварительного разведения исследуемого материала в стерильной водопроводной воде (или физиологическом растворе) используется для выделения чистых культур микроорганизмов, как аэробных, так и анаэробных. Готовят разведения материала в 10-100 раз и более (в зависимости от предполагаемой обсемененности микроорганизмами) и производят посев разведений, пользуясь поверхностным или глубинным методом.

     Выделение чистых культур строгих анаэробов  по методу Коха требует условий выращивания  без доступа кислорода.

     Посев шпателем на поверхность плотной  среды в чашке Петри (метод  Коха). Микробиологический шпатель (шпатель  Дригальского) используется для распределения клеток плотной среды в чашках Петри. В этом случае, инокулюм представляет собой суспензию микроорганизма. Обычно на поверхность среды в чашке наносят 0,1 ммл. суспензии с помощью пипетки. Совершая круговые («растирающие») движения шпателем, добиваются того, что суспензия равномерно распределяется по всей площади среды, жидкость впитывается в её толщу, а клетки остаются, прикреплёнными к поверхности. Если суспензия была концентрированной (содержала более 10 ⁵  клеток/ммл.), клетки будут располагаться в непосредственной вблизи друг к другу и после инкубирования будет наблюдаться сплошной рост, или газон клеток. В то же время с помощью посева шпателем можно получить изолированные колонии. Для это следует, либо развести высеваемую суспензию до концентрации ~ 10³  клеток/ ммл, либо произвести высев неразведённой суспензии на среду в трёх чашках Петри.

     Посев методом Коха на одну чашку Петри. На поверхность хорошо подсушенной (не менее 40 мин под фильтром) плотной  среды в чашке Петри наносят 0,1 ммл клеточной суспензии. Распределяют её круговыми движениями по всей площади среды с помощью микробиологического шпателя до тех пор, пока не будет ощущаться лёгкое сопротивление при перемещении шпателя, которое свидетельствует о том, что жидкость уже впиталась в толщу среды. Чашку закрывают и помещают в термостат вверх донышком.

     Если  разведение исследуемого материала  выполнено правильно, на поверхности  среды или в ее толще (в зависимости  от метода посева) образуются изолированные  колонии микроорганизмов, видимые  невооруженным глазом.

     Каждая  колония состоит из клеток одного вида, однако для выделения чистой культуры необходимо пересеять колонию  на отдельную среду, т.е. изолировать  ее от микроорганизмов других видов. 

     2.3 Методы анализа 

     2.3.1 Определение общего  количества микроорганизмов  методом культивирования

     Для определения общего количества микроорганизмов  методом культивирования были взяты  образцы почвы.

     Разведение  готовят в физиологическом растворе (ФР), используя шаг разведения 10. Для приготовления разведений с шагом 10 стерильный ФР разливают по 4,5 мл в стерильные пробирки, придерживаясь правил асептики. Затем в первую пробирку вносят 0,5 мл суспензии микроорганизмов – это первое разведение (10-1). Содержимое пробирки тщательно перемешивают, новой пипеткой отбирают 0,5 мл этой суспензии и переносят в другую пробирку с 4,5 мл ФР – получают второе разведение (10-2). Таким образом, готовят и следующие разведения.

     Проба почвы (1 г) была разведена в физрастворе (9 мл). Было приготовлено 3 разведения.

     После разбавления в физрастворе 3-го разведения были отобраны по 0,1см³ микроорганизмов это отобранное количество было засеяно в чашки Петри с приготовленной агаризованной среды. Равномерный засев проводился при помощи шпателя. Засеянные чашки были помещены в термостат с температурой 37ºС  и выдерживались в течении трех дней для роста колоний микроорганизмов. После накоплении биомассы микроорганизмов были проведены подсчеты выросших колоний и рассчитано общее количество клеток выросших на данных чашках (бактерий и грибов), что представлено в таблицах 6 и 7. 
 
 

Таблица 6 – Определение общего количества бактерий

Образец	1	2
a, количество колоний	150	125
f, степень развеления	3	3
v	0,1	0,1
Ni, число клеток	15*103	12,5*103
Nср	13,8*103
СКОN	1,25*103
e, %	9,06

 

     N = (13,8±1,25)*10³ 

Таблица 7 – Определение общего количества клеток грибов

Образец	1	2
a, количествоколоний	25	31
f, степень развеления	3	3
v	0,1	0,1
Ni, число клеток	2,5*103	3,1*103
Nср	2,8*103
СКОN	3*102
e, %	10,71