Курсовая по микробиологии

 

     N = (2,8±0,3)*10³ 

     Расчетные формулы: 
 
 
 

     e 

     Представление результата:  . 

     2.3.2 Построение калибровочной  зависимостей микроорганизмов  по спектру мутности

     Методы, основанные на измерении светорассеяния, широко используются для определения  параметров роста микробных популяций  – их концентрации и плотности. Основными  преимуществами этих методов являются быстрота и то, что при их применении клетки остаются в интактном состоянии. В основе методов определения светорассеяния лежит ослабление светового пучка при его прохождении через суспензию клеток. В определенных пределах оно обусловлено преимущественно рассеянием света клетками и пропорционально их концентрации. Величина этого показателя зависит от многих факторов (формы и размеров клеток, оптических свойств культуральной среды, длины волны света и др.), поэтому данные методы пригодны для определения концентрации лишь тех микроорганизмов, которые вызывают равномерное помутнение среды, и их рост не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образования мицелия, филаментов, пленок и других скоплений.

     Суспензии микроорганизмов, которые выглядят мутными, можно исследовать с  помощью турбидиметрии. Для измерения мутности широко принято использовать фотокалориметры или спектрофотометры. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, попадает на фотоэлемент. Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. Чем больше клеток на пути света, тем ниже интенсивность света, проходящего через пробу. При низком уровне мутности это явление описывается простой геометрической зависимостью, поскольку интенсивность нерассеиваемого света убывает экспоненциально с увеличением числа клеток. Однако при высоких концентрациях клеток в культуральной среде происходит вторичное рассеяние света, что приводит к занижению результатов.

     Большинство приборов для определения мутности имеет шкалу, градуированную в lg(I₀/I) – эта величина называется поглощением или оптической плотностью. Для измерения светорассеивания суспензий микроорганизмов выбирают длину волны (обычно в интервале 540-660 нм), при которой поглощение света данной суспензией клеток минимальное.

     Чтобы на основании показателей поглощения определить концентрацию клеток в суспензии  или ее плотность, необходимо построить  калибровочные кривые между величинами светорассеяния и числом клеток или  сухой биомассой в единице  объема. Для этого готовят ряд  разведений исследуемой суспензии, измеряют их поглощение и в каждой из них определяют одним из методов  количество клеток или биомассу. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси абсцисс показания концентрации клеток или плотности суспензии, а на оси ординат – показания  прибора [17]. 

     2.3.3 Оценка редуктазной активности микроорганизмов

     Для ускоренного анализа общей бактериальной  обсемененности используются экспресс-методы. Одним из таких наиболее простых и доступных методов является редуктазная проба.

     Преимуществом редуктазной пробы, помимо скорости анализа, является также более высокая точность получаемых результатов по сравнению с определением числа бактерий методом посева на чашках, однако редуктазный метод имеет ряд недостатков:

1. Зависимость длительности измерения от видового состава микрофлоры.
2. Низкий коэффициент корреляции показаний редуктазной пробы с общей численностью микроорганизмов, определенной методом посева на чашках.

     Редуктазную пробу применяют для определения степени обсеменения образца почвы микрофлорой. Этот метод относится к косвенным методам определения количества бактерий в почве. Сущность ее основана на установлении биохимической активности микробов, продуцирующих фермент редуктазу, которая способна обесцвечивать некоторые краски, в частности метиленовую синь. В основу метода положено определение времени, необходимого для обесцвечивания метиленовой сини. Преимущество редуктазной пробы в сравнении с прямым бактериологическим методом состоит в быстроте получения результате (примерно через 5,5 ч). Однако не все микроорганизмы обладают редуцирующей активностью. В большей степени это свойство имеют кишечные палочки, маслянокислые и гнилостные бактерии, несколько меньше – сальмонеллы и стафилококки.

     Для постановки редуктазной пробы в пробирки отмеряют 5 мл растворов 1, 2, 3, 4 разведения добавляют 0,5 мл рабочего раствора метиленовой сини и плотно закрывают пробкой. После перемешивания пробирку помещают в водяную баню при температуре 37-40 С, наблюдая за временем обесцвечивания метиленовой сини через 20 мин, 2 и 5 ч. Для приготовления рабочего раствора берут 5 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и добавляют 195 мл дистиллированной воды.

     Время наступления обесцвечивания содержимого  пробирки указывает на приблизительное  количество в исследуемом молоке микроорганизмов, продуцирующих фермент  редуктазу.

     Полученные  результаты оценки редуктазной активности микроорганизмов почвы содержаться в таблице 8. 
 
 

Таблица 8 – Редуктазная активность микроорганизмов почвы

Разведение	0	1	2	3	4
Длительность  обесцвечивания	7 мин	15 мин	23 мин	32 мин	51 мин

 

     Микрокалориметрический анализ общего количества является одной из альтернатив редуктазной пробы. Длительность биокалориметрического метода составляет 30 мин, что в 3 раза быстрее редуктазной пробы. 

     2.3.4 Измерение тепловыделения  микроорганизмов  почвы

     Микроорганизмы  обладают высоким уровнем тепловой активности и выделяют 10^-10-10^-14 Вт/кл. При современном уровне чувствительности микрокалориметров это позволяет регистрировать 10⁴-10⁵ кл/см³ в течение часа. В сочетании с методом культивирования микроорганизмов микрокалориметрический метод способен зарегистрировать 10⁰-10¹ кл/см³, однако время анализа возрастает до 10 ч.

     Методы  микрокалориметрии позволяют не только измерить теплопродукцию отдельных видов микроорганизмов, но и изучить положительное и отрицательное влияние различных факторов на метаболизм клеток.

     Для анализа жизнедеятельности микроорганизмов  используются термограммы. Различают  дифференциальные и интегральные термограммы.

     При дифференциальной термограммой понимают зависимость мощности тепловыделения образца от времени наблюдения.

     Интегральная  термограмма отражает общее количество тепла, выделенного к определенному  моменту, как функцию времени. Микрокалориметр  непосредственно регистрирует дифференциальную термограмму, и затем рассчитывается интегральная термограмма.

     Биокалориметрический анализ проводился при помощи микрокалориметра МКЦ-Ц. Перед тем как приступить к работе с прибором, его необходимо прогреть в течение 1 часа. После чего установив параметры, необходимые для измерения, можно приступать к измерениям. К прибору прилагаются 2 микрокюветы объемом 1 мл, которые заполняются раствором сравнения (дистиллированная вода) и суспензией изучаемых микроорганизмов. От полученной суспензии отбирали 0,5 мл и помещали в микрокювету на 1 мл. в эту же кювету помещали 0,5 мл питательного бульона, необходимого для питания микроорганизмов. В другую кювету помещали 1 мл дистиллированной воды. Заполненные кюветы помещали в микрокалориметр и проводили измерения.

     В таблице 9 содержится зависимость мощности тепловыделения образца почвы (S, мкВт) и количество выделенного тепла (Q, мДж) от времени наблюдения. 

Таблица 9

t, мин	2	4	6	8	10
S, мкВт	0	198	315	383	446
Q, мДж	351	1291	2031	2868	3612

 

     Также в ходе выполнения эксперимента были построены дифференциальная и интегральная диаграммы тепловыделения микроорганизмов почвы (рисунки 2 и3). 
 

       

     Рисунок 2– Графическая зависимость мощности тепловыделения образца от времени наблюдения 
 

       
 

     Рисунок 3– Графическая зависимость количества выделенного тепла образца от времени наблюдения 
 
 
 
 
 

Заключение 

     В ходе выполнения курсовой работы были подробно рассмотрены методы контроля микробиологического состава почв, методы контроля дыхания почв, биокалориметрический метод определения содержания микроорганизмов в почве, влияние физико-химических факторов на дыхание микроорганизмов почв. В экспериментальной части было проведено определение общего количества бактерий и грибов методом культивирования, оценка редуктазной активности микроорганизмов, измерение тепловыделения микроорганизмов почв. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  использованной литературы 

     1 Звягинцев, Д.Г. Почва и микроорганизмы / Д.Г. Звягинцев. – М.: МГУ, 2002. –  120 с.

     2 Бабьева, И. П. Биология почв / И. П. Бабьева, Г. М. Зенова. – М.: МГУ, 2005. – 448 с.

     3 Гусев, М. В. Микробиология / М. В. Гусев, Л. Н. Минеева.  – М.: МГУ,  1985. – 376 с.

     4 Микроорганизмы и плодородие / Ж.  Войнова-Райкова [и др.]; пер. с болг. – М.: Агропромиздат, 1986.- 120 с.

     5 Практикум по биологии почв: учеб. пособие / Г.М Зенова [и др.]. – М.: МГУ, 2002. – 120 с.

     6 Почвенные микроорганизмы и интенсивное  земледелие / Е.И. Андреюк [и др.]. – Киев: Наукова думка, 1988. – 189 с.

     7Мин-во  СХ грузинской ССР, упр. Науки  и пропаганды. Методика изучения  воздушного режима почвы в  стационарных условиях. Тбилиси, 1982.

     8 Сравнительная оценка микробной  биомассы почв, определяемой методами  прямого микроскопирования и субстрат-индуцированного дыхания / Н.Д. Ананьева [и др.] // Микробиология. – 2008. - № 3. – с. 404-412.

     9 Сэги, Йожеф Методы почвенной микробиологии / Йожеф Сэги; пер. с венг. – М.: Колос, 1988. – 298 с.

     10 Игнатенко, А.В. Микробиологические, органолептические и визуальные  методы контроля качества пищевых  товаров. Микрокалориметрия: лабораторный практикум / А.В. Игнатенко, Н.В. Гриц. – Мн.: БГТУ, 2003. – 114 с.

     11 Методы почвенной микробиологии  и биохимии / под ред. Д.Г. Звягинцева. – М.: МГУ, 1991. – 302 с.

     12 Федосова, Н.Х. Микробиология: учеб. пособие. – Мн.: Ураджай, 2001. – 197 с.

     13 Мишустин, Е.Н. Микробиология / Е.Н Мишустин, В.Т. Емцев. – М.: Агропромиздат, 1987. – 368 с.

     14 Теория и практика химического  анализа почв / под ред. Л.А Воробьевой. – М.: ГЕОС, 2006. – 400 с.

     15 Экология почв: учеб. пособие. Часть 3. Загрязнение почв / В.Ф. Вальков [и др.]. – Ростов-на-Дону: УПЛ РГУ, 2004. – 54 с.

     16 Наумов, А.В. Дыхание почвы: состав, экологические функции, географические  закономерности / А.В. Наумов. – Новосибирск:  СО РАН, 2009. – 208 с.

     17 Белясова, Н.А. Микробиология. Лабораторный практикум: учеб пособие. – Мн.: БГТУ, 2007. – 160 с.