Курсовая по микробиологии

     Антропогенные воздействия (удобрения, пестициды, загрязнения  в виде тяжелых металлов); независимо от природы действующего фактора, изменяют микрофлору, активно ведущую процесс  в соответствии с общими законами.

     Подход  дает возможность определять ряд  микробиологических характеристик  почв, в том числе и допустимые нагрузки того или иного фактора  на почву. При увеличивающихся нагрузках  каждый фактор вызывает в микробном  сообществе изменения, соответствующие  следующим состояниям системы: состоянию  гомеостаза, стресса, развития резистентных форм, репрессии.

     Ацетиленовый  метод определения потенциальной  активности азотфиксации.

     5 г освобожденной от корешков  и просеянной через сито с  диаметром ячеек в  1 мм почвы  помещают в пенициллиновый флакон, вносят 1-2% глюкозы (от веса абсолютно  сухой почвы) и увлажняют стерильной  водой до влажности 60% полевой  влагоемкости. Почву перемешивают стеклянной палочкой до получения однородной по влажности массы, закрывают флакон ватной пробкой и помещают в термостат на 28°С. Из каждого почвенного образца отбирают не менее трех навесок для определения потенциальной активности азотфиксации. Через сутки инкубации в термостате закрывают флаконы резиновыми пробками и вводят в каждый флакон по 0,5 мл ацетилена, после чего вновь помещают их в термостат на 1 ч. Через час из каждого флакона отбирают газовую пробу в 0,5 мл и вводят ее в газовый хроматограф. В параллельной навеске проводят контрольное определение на  восстановление ацетилена до этилена во флаконе с 5-тью мл воды при отсутствии почвы. Колонка газового хроматографа обеспечивает разделение газов метана, пропана, этилена, ацетилена. Объем пробы газовой смеси 0,5 мл. Пробу вводят медицинским шприцем. Расчет величины активности азотфиксации проводят, исходя из того, что соотношение между количеством образованного этилена и соответствующим количеством азота составляет 3:1, т.е. результат, полученный для этилена делят на 3, чтобы получить  величину активности фиксации азота. После окончания измерений резиновые пробки вновь заменяют на ватные, флаконы ставят на сутки в термостат, после чего определение повторяют до тех пор, пока в двух соседних по времени пробах количество этилена не будет отличаться более чем на 5%. Потенциальную активность азотфиксации выражают в миллиграммах фиксированного азота на килограмм почвы за час (мг/кг/ч).

     Определение потенциальной активности денитрификации в почве.

     Навеску воздушно-сухой почвы (5 г) помещают в пенициллиновый флакон объемом 15 мл, увлажняют до 60% от полевой влагоемкости и инкубируют при 28°С 2-3 суток. После этого вносят глюкозу (2,5 мг/г), нитрат калия (0,2 мг/г), добавляют 5 мл стерильной дистиллированной воды, флаконы закрывают резиновыми пробками, которые фиксируют зажимами. Воздух вытесняют аргоном и вводят 1 мл ацетилена. После этого флаконы тщательно встряхивают, переворачивают вверх дном и инкубируют при 28°С 1-24 ч. Анализ газов проводят на газовом хроматографе М-3700 с детектором по теплопроводности. Длина колонки – 3,5 м, диаметр – 3 мм, наполнитель Раrарак-Q, ток питания катарометра – 148 мА, температура испарителя термостата – 30°. Расход газа носителя (гелия) – 30 мл/мин. Активность денитрификации выражают в миллиграммах азота на 1 кг почвы за час (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

     Методы  определения в почве активности ферментов.

     Наиболее  простыми из них по выполнению являются методы определения активности дегидрогеназ и инвертазы (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

     Для определения активности дегидрогеназ в почве в качестве акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2, 3, 5-трифенилтетразолий хлористый, ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенил-формазан, ТФФ). Навеску почвы 1 г помещают в 50-миллилитровую вакуумную колбу с притертыми стеклянными пробками, добавляют 10 мг углекислого кальция и тщательно смешивают. Для определения дегидрогеназ лучше использовать свежие образцы почвы, так как при высушивании образцов почвы активность де-гидрогеназы падает до 50-80% (для дерново-подзолистой почвы). Затем добавляют 1 мл 1%-ного раствора ТТХ. Определение проводят в анаэробных условиях, для этого воздух из колбы эвакуируют при разрежении 10-12 мм рт. ст. в течение 2-3 мин. Колбы осторожно встряхивают и ставят в термостат при 38°С на 24 ч. Контролем служит стерилизованная почва и субстраты без почвы. После окончания инкубации в колбы добавляют по 25 мл этилового спирта и встряхивают в течение 5 мин. Содержимое колбы фильтруют и полученный раствор ТФФ анализируют на фотоэлектроколориметре, используя кюветы шириной 5 мм и синий светофильтр с длиной волны 500-600 нм. Количество формазана в мг рассчитывают по стандартной кривой. Для составления калибровочной кривой готовят стандартный раствор формазана в этиловом спирте (0,1 мг в 1 мл), затем в мерные колбы на 25 мл берут соответствующее количество стандартного раствора, содержащее от 0,1 до 1,0 мг формазана, этанолом доводят до метки и фотоколориметрируют согласно вышеописанному способу. Активность дегидрогеназ выражают в миллиграммах ТФФ на 10 г почвы за сутки. Ошибка определения – до 8%.

     Фотоколориметрический метод определения активности инвертазы  заключается в следующем. В колбу  емкостью 50 мл помещают 5 г почвы, добавляют 10 мл 5%-ного раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 5-6 капель толуола. Колбы закрывают пробками, встряхивают и помещают в термостат при температуре 30°С на 24 ч, периодически встряхивая их. Контроль – стерилизованная почва (3 ч при 180°С) и чистый субстрат.

     После инкубации содержимое колб фильтруют  в 100-миллилитровые мерные колбы. Из фильтра берут 6 мл в большие пробирки, добавляют 3 мг сегнетовой соли и 3 мл раствора сернокислой меди, хорошо перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 10 мин. Затем пробирки с раствором охлаждают в холодной воде, содержимое переносят в пробирки и центрифугируют в течение 5-7 мин при 3000 об/мин. Прозрачный центрифугат колориметрируют на фотоэлектроколориметре (светофильтр – 630 нм), кюветы шириной 1 см. Количество глюкозы рассчитывают по предварительно составленным калибровочным кривым. Исходный стандартный раствор – 6 мг глюкозы в 1 мл. Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за сутки. Ошибка определения – до 5%.

     Весьма  плодотворной является оценка обогащенности генетических  горизонтов микроорганизмами и ферментами по всему почвенному профилю в различных типах почв, предложенная Д.Г. Звягинцевым, согласно которой активность почвенных ферментов рассчитывается на столбик с площадью сечения в 1 см с учетом глубины исследуемого слоя почвы.

     Методы  определения биомассы микроорганизмов  в почве. Наиболее эффективными и  современными являются регидратационный и кинетические методы [12].

     Принцип регидратационного метода определения микробной биомассы в почве состоит в следующем. Мягкое высушивание почвы (65-70, 24 ч) избирательно действует на живые микробные клетки, происходит нарушение целостности цитоплазматических мембран, которое может быть в зависимости от природы конкретного микроорганизма полным (необратимым) или обратимым. На мертвое органическое вещество почвы высушивание при относительно низкой температуре практически не действует. В ходе регидратации высушенной почвы (встряхивании почвенного образца с водой или слабым раствором нейтральной соли) внутриклеточные компоненты высвобождаются в раствор и могут быть определены любым достаточно чувствительным аналитическим методом. В практике микробиологических исследований содержание клеточных компонентов определяют по сумме органических соединений, по N-содержащим соединениям, калию и фосфору. Кроме того, можно оценивать соединения индивидуальной природы, находящиеся до момента высушивания внутри клеток почвенных микроорганизмов – нуклеиновые кислоты, полисахариды, белки. Вариант регидратационного метода с регистрацией количества микробной массы по сумме органических веществ состоит в следующем: 5 г почвы помещают в коническую колбочку на 50 мл и оставляют в термостатируемом сушильном шкафу при температуре 65-700 на сутки. Затем готовят вытяжку из почвы 0,5 М К S0 (соотношение почва: раствор равняется 1:5 для почв с высоким содержанием 0В и 1:2 для бедных почв), встряхивая суспензию на качалке или вручную в течение 30 мин. Суспензию центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют содержание органических веществ методом бихроматного окисления. Для этого 1,6 мл прозрачной вытяжки смешивают с 2,4 мл сернохромовой смеси (готовят, растворяя 6 г К₂Сr₂О₇ в 400 мл воды, затем приливают 2 л концентрированной Н₂SО₄ ), пробирки помещают в термостат при 140°С на 20 мин, охлаждают и спектрофотометрируют при 590 нм.

     В качестве стандартов используют растворы глюкозы в концентрационном диапазоне 100-500 мг С/л. Параллельно ставят контрольное определение с почвой без высушивания. Количество микробной биомассы рассчитывают по формуле: 

                                                                                 С-С₀

                                                                       х = ¾¾¾¾,                                                                (15)

                                                                                 0,3  

     где x – углерод микробной биомассы (мкг/г почвы); С и С₀ – количество водорастворимых соединений в почве после высушивания и в свежем образце соответственно; 0,3 – пересчетный коэффициент, равный доле солюбилизирующихся после регидратации клеточных компонентов.

     В работе используются только свежие почвенные  образцы, в воздушно- сухих почвенных образцах биомасса микроорганизмов резко снижается.

     Принцип кинетических методов определения  биомассы микроорганизмов в почве  состоит в следующем. Скорость любого микробиологического процесса (нитрификации, потребление органических веществ  или их окисления до СО₂, нитратредукции, азотфиксации, окисления Fe и прочих) зависит в основном от трех факторов: количества (биомассы) соответствующих микроорганизмов, концентрации субстрата данного процесса и условий его протекания. Если в почву внести субстрат микробиологического процесса в насыщающей концентрации, а условия жизнедеятельности микробного населения (влажность, температура, газообмен с воздухом) поддерживать на постоянном оптимальном уровне, то скорость процесса V будет пропорциональна количеству микроорганизмов X, тогда: 

                                                                              V

                                                                     X = ¾¾,                                                                       (16)

                                                                              Q 

     где коэффициент пропорциональности Q есть одновременно и пересчетный коэффициент  от скорости к биомассе. По своему биологическому смыслу Q является удельной скоростью  превращения субстрата. В микробиологической кинетике существуют фундаментальные  соотношения между Q, удельной скоростью роста m и экономическим коэффициентом или выходом биомассы по субстрату Y:  

                                                                               m

                                                                     Q = ¾¾.                                                                       (17)

                                                                               Y  

     Для того чтобы найти численные значения Q, m, и Y для конкретной почвы, ставят однократно эксперимент, в котором после внесения субстрата микроорганизмам "дают возможность" подрасти. При этом в динамике измеряют скорость потребления субстрата (она растет экспоненциально при неограниченных ресурсах питательных веществ), а также стехиометрические соотношения между субстратами и продуктами микробного роста. По динамике V находят m, а по стехиометрии процесса – Y. Поясним путь расчета Y на конкретных примерах:

     1) при определении биомассы водорослей  и других фотосинтезирующих почвенных  микроорганизмов измеряют V по скорости  фотоассимиляции СО₂ (используют 14СО₂, либо измеряют разницу в скорости выделения СО2  темноте и на свету), Y в этом случае равен 1, так как размеры фотоассимиляции углерода равны приросту альгомассы;

     2) при определении биомассы водородных  бактерий измеряют скорость потребления  водорода, а для оценки коэффициента  одновременно регистрируют сопутствующее  потребление СО₂ (по разнице между скоростями выделения СО₂ почвой в присутствии H₂ и без него). Величина Y равна частному от деления DCO₂/DH₂ ;

     3) при определении биомассы микроорганизмов,  аэробно использующих глюкозу,  прослеживают динамику потребления  внесенной в почву глюкозы  и выделения СО₂. Прирост биомассы находят по уравнению материального баланса DХ = DS-DСО₂, где DХ, DS и DСО₂ – cоответственно прирост углерода микробной биомассы, потребление углерода глюкозы и выделение углерода СО₂. Величину m находят по динамике интенсивности выделения СО₂ как более точно регистрируемой переменной.