Курсовая по микробиологии

     Длинные разветвленные нити, или гифы, составляют тело гриба, называемое мицелием, или  грибницей. У некоторых грибов гифы представляют собой нити без поперечных перегородок. Большинство грибов имеют  гифы с поперечными перегородками (септами), разделяющими их на участки. На основании этих морфологических  отличий грибы делят на низшие – несептированные и высшие – септированные.

     По  размерам грибы значительно крупнее  бактерий и актиномицетов. Диаметр  их гиф колеблетсяот 5 до 50 мкм и более.

     Грибы относятся к весьма широко распространенной в природе группе организмов. Их обнаруживают во всех естественных субстратах (почвах, растительных и животных остатках и т.п.), продуктах питания и  т.п. Среди грибов имеются не только сапрофиты, но и паразиты и даже хищники. В почве эти организмы разлагают различные органические вещества, в том числе такие сложные соединения, как целлюлоза, лигнин и др. Грибы могут вызвать порчу пищевых продуктов, деревянных построек, изделий из каучука и резины, нефтепродуктов и т.п. Кроме того, некоторые из них являются возбудителями болезней растений, животных и человека.

     В царство Mycota входят собственно грибы, или истинные грибы (Eumycota) и слизевики, или миксомицеты (Myxomycota).

     Определение количества и биомассы грибов в почве [6]

     Учет  количества и биомассы грибов по методу Хансена в модификации Мирчинк Т.Г.

     Для определения численности грибов и их биомассы используются мембранные фильтры. Работа предусматривает отбор  навески воздушно-сухой почвы (1-2 г). Почву растирают в фарфоровой ступке, затем помещают в мерную колбу на 500 мл и заливают стерильной дистиллированной водой до метки. Почвенную суспензию выливают в мерный цилиндр на 500 мл и, не давая отстояться почвенным частицам, 10 мл взвеси наносят на фильтр Зейтца. Его готовят следующим образом: на металлическую сеточку фильтра закладывают 6 слоев фильтровальной бумаги, вырезанной по диаметру цилиндра фильтра. Поверх фильтровальной бумаги накладывают предварительно прокипяченный фильтр «Синпор» с диаметром пор 2,5 мкм. Все частицы меньшего диаметра пройдут через фильтр, а большего размера, мицелий гриба и споры останутся на нем. Фильтр подсоединяют к вакуумному или водоструйному насосу и откачивают воздух. Жидкость с поверхности фильтра переходит в колбу. Поверхность фильтра промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.

     Мембранные  фильтры с остатками почвенных  частиц и мицелием грибов снимают  с фильтра, просушивают до воздушно-сухого состояния, после этого фильтр окрашивают дианиловым голубым или метиленовым синим в течение 2 ч. Окрашенный фильтр просушивают и осветляют иммерсионным маслом, обычно несколько капель равномерно распределяют по всей поверхности фильтра. В таком виде фильтр готов для микроскопирования. Фильтр помещают на столик микроскопа И при увеличении 40х10 (для подсчета количества и длины гиф) или 90х10 (для подсчета спор) проводят учет численности грибов в 50 полях зрения па каждом фильтре. При этом измеряют длину, подсчитывают количество фрагментов мицелия и число спор. Равномерным считается распределение грибов па поверхности фильтра, если в одном поле зрения находятся 1-3 обрывка мицелия и 1-2 споры.

     Суммарную длину мицелия в 1 г почвы рассчитывают по формуле: 

                                                       (3) 

     где а – длина гиф в 1 г почвы, см; b – суммарная длина гиф на фильтре в 50 полях зрения в единицах окуляр-микрометра; х – цена деления окуляр-микрометра, мкм; S – площадь фильтра, мм^2-; п – разведение почвенной суспензии; Р – площадь поля зрения, мкм²; V – объем наносимой суспензии; С – навеска почвы, г.

     Объем гиф (см³), рассчитывается по формуле: 

                                                           p.                                                                  (4) 

     Количество  спор определяют на том же фильтре  при увеличении 90х10 в 50 полях зрения. Подсчет числа спор в 1 г почвы проводят по формуле: 

                                                                                                                                 (5) 

     Где M – количество спор в 1 г почвы; т – число спор в 50 полях зрения; S – площадь фильтра, мм²; п – разведение  почвенной суспензии; Р – площадь поля зрения, мкм²; V – объем наносимой суспензии; С – навеска почвы, г.

     Биомассу  спор рассчитывают по формуле: 

                                                                                                                                              (6) 

     где V – объем споры; d – плотность, равная 1,2.

     Объем споры рассчитывают по формуле: 

                                                               pab                                                               (7) 

     где а – больший, b – меньший диаметр спор, мкм.

     Определение количества грибов и  их биомассы прямым микроскопированием [6]

     Наиболее-распространенным методом учета численности и биомассы грибов считается метод, описанный Джонсом и Молпсоном, или метод агаровых пленок.

     Навеску исследуемой почвы (1-5 г) растирают  в фарфоровой чашке и заливают 100 мл 1,5 %-ного агара. Каплю такой суспензии наносят тонкой пленкой на камеру Горяева. Подсчет проводят в 40 квадратах камеры в трех поверхностях. Длину гиф измеряют с помощью окуляр-микрометра. Определение биомассы проводят с учетом плотности мицелия, принятой 1,2 г/см³, и диаметра гиф 5 мкм. Вначале проводят пересчет на 1 см³ почвы с последующим пересчетом на 1 га.

     Расчеты па 1 га почвы проводят по формуле, предложенной Т. Г. Мирчинк: 

                                                         ×                                                             (8) 

     где а – суммарная длина грибных гиф в 1 г почвы, см; b – длина гиф в единице окуляр-микрометра; X – цена деления окуляр-микрометра, мкм; с – навеска почвы, г.

     Площадь квадрата камеры Горяева 1/250 мм², глубина 0,1 мм. Объем гиф (см³) рассчитывают по формуле: 

                                                                      p                                                                      (9) 

      

     1.2.2 Методы определения  содержания бактерий

     Методы  обнаружения и количественного  учета бактерий в почве основаны на том, что возможность биологических  методов учета почвенных бактерий ограничена в том смысле, что нельзя предложить среды, обеспечивающей рост всех почвенных бактерий. В зависимости  от целей исследования для учета  бактерий употребляются различные  питательные среды. В некоторых  случаях необходимо использовать среды, обеспечивающие рост возможно большего количества бактерий, например среды, приготовленные из почвенной вытяжки. Почвенная вытяжка готовится  следующим образом: 1 кг хорошо окультуренной  почвы заливают 1 л водопроводной  воды, автоклавируют, после чего дают отстояться. 

     Жидкость  сливают и фильтруют через  двойной фильтр, который нейтрализуют до рН 7,2. К 100 мл почвенной вытяжки добавляют 900 мл дистиллированной воды и 15 г агара. Кипятят, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 30 мин.

     Существуют  селективные методы для выделения  из почвы отдельных групп почвенных  бактерий.

     Количественный  учет бактерий можно проводить методом  посева из почвенной суспензии на плотные среды. Однако нужно помнить, что чашечный метод дает возможность  выделить только одну узкую группу почвенных бактерий. Общее количество бактерий возможно учесть только прямым микроскопированием.

     Прямой  микроскопический метод подсчета бактерий стал возможен только после того, как  X.Кон и С.Н.Виноградский предложили применять для окрашивания почвенной суспензии кислые краски, которые хорошо окрашивают клетки микроорганизмов и слабо – почвенные частицы. Этот метод позволил установить, что в почве содержится в тысячи раз большее количество микроорганизмов, чем то, которое удается учесть методом посева  почвенных суспензий на агаризованные среды. [5]

     Определение биомассы бактерий в почве [6]

     Для определения биомассы бактерий используют метод С. Н. Виноградского. Для этого  из почвенной суспензии исследуют  несколько фракции. Каждую из них  наносят на предварительно взвешенное предметное стекло, распределяют почвенную  взвесь на площади 4 см². Мазки высушивают, взвешивают, фиксируют, окрашивают эритрозином и подсчитывают количество клеток под микроскопом. Зная площадь и массу мазка, определяют количество бактерий в каждой фракции почвенной взвеси.

     Предложенный  метод имеет ряд преимуществ  по сравнению с традиционными методами учета бактерий на средах, однако он трудоемок, так как взвешивание предметных стекол необходимо проводить по несколько раз до и после нанесения мазка.

     В практике микробиологических исследований широкое применение нашел этот метод  в упрощенной модификации О. Г. Шульгиной  с предварительной обработкой почвенной суспензии ультразвуком.

     Отбор почвенной пробы проводят следующим  образом: стерильной лопаточкой или  ножом снимают верхний (1-3 см) слой почвы, наиболее подверженный ветровому  воздействию и солнечной инсоляции. С обнаженного горизонта и необходимой глубины отбирают почвенную пробу и вносят в стерильный мешочек. Почву отбирают в 3-6 точках по диагонали поля и делают усредненный образец. Из среднего образца почвы взвешивают 5 г и помещают в коническую колбу объемом 250 мл. Почву заливают 45 мл стерильной водопроводной воды. Почвенную взвесь гомогенизируют на встряхивателе. Лучшие результаты получаются при обработке почвенной суспензии ультразвуком на ультразвуковой установке УЗДН-1 или УЗДН-2 в течение 3 мин при силе тока 0,4 А и частоте колебаний 15 кГц. После диспергирования почвенной смеси дают отстояться 5-7 с, за это время крупные почвенные частицы успевают осесть. Микропипеткой отбирают 0,1 мл почвенной взвеси и наносят одну каплю объемом 0,01 мл на предметное стекло. Одновременно на стекло наносят и каплю 0,1%-ного очищенного от микробных клеток агара. На стекле предварительно восковым карандашом наносят прямоугольник площадью 8 см². Взвесь бактериальной петлей равномерно распределяют по всей поверхности прямоугольника. Препарат подсушивают, фиксируют над пламенем газовой горелки или 95 %-ным этиловым спиртом и окрашивают карболовым эритрозином. Окрашивание продолжается от 1 до 24 ч. Во время окрашивания препарат не должен пересыхать, для чего его помещают в эксикатор, на дне которого имеется вода, или погружают в стаканчик с красителем. Излишки краски по истечении 1 ч или 1 сут смывают, периодически погружая предметное стекло в стакан с водой. Затем препараты высушивают и подсчитывают в них количество клеток при микроскопировании с масляной иммерсией. Опыт ставят в 3-кратнон повторности, т. е. готовят по три предметных стекла. На каждом из них просчитывают по 50 полей зрения и определяют среднее количество клеток на одном поле зрения. Зная площадь его, легко определить и количество бактерий в 1 г почвы.

     Расчет  количества клеток в 1 г воздушно-сухой  или абсолютно сухой почвы  проводят по формуле: 

                                                            ××××                                                              (10) 

     где А – среднее количество учтенных на стекле клеток; Б – площадь поля зрения (мкм^а), определяется с помощью объектив-микрометра; В – объем нанесенной суспензии, мл; Г – количество просчитанных полей зрения; p – влажность почвы, %; 8×10⁹  – площадь мазка (мкм²) и показатель разведения.

     Одновременно  с учетом количества клеток измеряют их длину и ширину, затем рассчитывают среднюю величину клеток микроорганизмов. Полученные расчеты позволяют определить биомассу бактерий в почве. Подсчитанное количество клеток в 1 г почвы умножают на средний объем клетки и на их плотность. Полученные данные позволяют определить биомассу в т/га по сырой и сухой массе. При определении биомассы микроорганизмов следует исходить из следующих предпосылок: средний размер почвенных бактерий – 0,1 мкм³, средний диаметр гиф стрептомицетов – 0,5, грибов – 5 мкм, плотность бактерий – 1,1 г/см³. Для более точных определений нужно в каждой конкретной почве учитывать средний размер микроорганизмов. Сухая биомасса составит 1/5, т. е. 80 % сырой биомассы составляет вода.

     Следует, однако, помнить, что при определении  биомассы микроорганизмов образцы почвы необходимо отбирать ежедневно в одно и то же время.

     Морфологию  живых бактериальных клеток изучают  в препаратах "раздавленная капля", микроскопируя их при большом увеличении с иммерсионным объективом (´90). Отмечают размеры клеток, измеряя их окуляр-микрометром, подвижность клеток (используют 12-24-часовую культуру), форму клеток. Для исследования деталей строения клетки – органоидов, спор, жгутиков, различных включений – приготавливают фиксированные и окрашенные  препараты. Препарат бактерий для фиксации и окраски (мазок) готовят на чистых обезжиренных стеклах. На приготовленное стекло наносят каплю суспензии бактериальных клеток и размазывают ее тонким слоем по поверхности стекла с помощью петли или краем покровного стекла. Мазки высушивают при комнатной температуре. 

     При фиксации необходимо возможно полнее сохранить прижизненную структуру  бактериальных клеток. Известно много  способов фиксации препарата, наиболее распространенный – фиксация жаром (фломбирование). Стекло с высушенным мазком проводят три-четыре раза через пламя горелки мазком вверх, пока не появляется ощущение жжения при прикладывании стекла к тыльной стороне руки. Для изучения формы клетки этот способ фиксации удовлетворителен. Для исследования тонкого строения  бактерий препараты фиксируют химическими веществами – безводным метиловым спиртом (5 мин), 96%-ным этиловым спиртом (5 мин), смесью равных объемов этилового спирта и эфира (20 мин), фиксатором Карнуа (этиловый спирт – 60 мл, хлороформ – 30 м, ледяная уксусная кислота – 10 мл; фиксация – 15 мин).