Курсовая по микробиологии

     После фиксации препарат окрашивают. Существуют различные методы покраски. Наиболее употребительные красители: метиленовый  синий (спиртовой или водный раствор); фуксин основной (спиртовой или односпиртовой раствор), применяются и более сложные методы покраски с использованием нескольких красителей, например, окраска по Граму [5].

3. Методы контроля дыхания почв

     Почва – важный источник углекислого газа, который потребляется растениями в  процессе фотосинтеза. Газообмен между  почвой и атмосферой осуществляется посредством таких факторов, как  диффузия, изменения барометрического давления, температуры почвы и  воздуха, поступления в почву  воды, а также при помощи ветра. Увеличивая объем при нагревании почвы, воздух ее частично выходит наружу, при охлаждении почвы почвенные  поры получают новую порцию воздуха  из атмосферы.

     Всякому животному, чтобы жить, необходимо дышать. Для дыхания в почве иные условия, чем в воде или в воздухе. В  состав почвы входят твердые частицы, вода и воздух. Твердые частицы  в виде небольших комочков занимают немногим более половины объема почвы; остальной объем приходится на долю промежутков – пор, которые могут  быть заполнены воздухом (в сухой  почве) или водой (в почве, насыщенной влагой). Как правило, вода покрывает  тонкой пленкой все почвенные  частицы; остальное пространство между  ними занято воздухом, насыщенным водяными парами.

     При поступлении воды в почву «старый» воздух из почвенных пор вытесняется и они заполняются «новым» воздухом после оттока из них влаги.

     Состав  почвенного воздуха отличается от состава  воздуха атмосферного содержанием  в нем углекислого газа (СО₂) и молекулярного кислорода (О₂) [7]. Соотношение этих газов изменяется с течением времени при определенных условиях, причин этому несколько, например деятельность микроорганизмов. К воздушному режиму почвы относится также и интенсивность обмена газами между почвой и атмосферой. Это важный фактор почвенного плодородия. Свободный почвенный воздух располагается во всех порах, незанятых водой. Их количество зависит от общей пористости,от структуры почвы и от влажности почвы. Оптимальной является влажность 60-80% от полной влагоемкости. Суммарная величина пористости достигает 80% в легких почвах, а в торфяных превышает 90%. Воздухоемкость почв может колебаться в пределах от 20 до 90% от общего Объема почвы. Поскольку в природе почва всегда содержит влагу значение воздухоемкости почв ниже указанных величин.

     Важным  свойством почв является их воздухопроницаемость – способность почвы пропустить через себя воздух. Воздухопроницаемость – условие осуществления газообмена между почвой и атмосферой. Передвижение воздуха по почве происходит по порам, незаполненным водой и неизолированных друг от друга. Чем крупнее поры аэрации, тем лучше выражена воздухопроводность. Если состав атмосферного воздуха постоянен и колебания его основных компонентов незначительны, то почвенный воздух отмечен меньшим постоянством содержания своих основных компонентов. В нем, как правило, меньше кислорода и больше углерода (до 20%). Азота может быть больше в почвенном воздухе, чем в атмосферном, вследствие распада белков и денитрификации азот-содержащих веществ под действием микроорганизмов. Уменьшение азота зависит от связывания этого вещества азотфиксирующими и клубеньковыми бактериями. В почвах с затрудненным газообменом концентрация кислорода может сильно сокращаться (до десятых частей процента). На содержание углекислого газа и кислорода влияет дыхание огромного количества организмов, которые населяют почву. Особенно верхних ее горизонтов.

     Основными потребителями кислорода являются корни растений, микроорганизмы, животное население. И лишь незначительная его  часть расходуется на чисто химические процессы окисления (с выделением углекислого  газа и воды). Количество кислорода, потребляемое растениями (высшими и  низшими) зависит от особенностей физиологии растений, возраста, их количества, условий  среды. Максимальное потребление кислорода  у высших растений приходится на период цветения. Основная масса кислорода  в почве расходуется в процессе аэробного дыхания. В оптимальных  условиях аэрации дыхательный коэффициент (ДК) равен единице – это количество выделяемого углекислого газа эквивалентно количеству поглощенного за это время  кислорода. Следовательно, по углекислому  газу можно судить о количестве поглощенного кислорода. Огромное влияние на ДК оказывает  содержание в почве кислорода, при  недостатке которого ДК всегда больше 1. Поэтому для почв с пониженным газообменом и пониженным содержанием  кислорода пользоваться этим методом  нельзя. Нормально аэрируемые почвы, занятые растениями, летом в среднем  могут выделять до 2-10 л/м в сутки  углекислого газа и примерно столько  же кислорода.

     Основной  объем газообмена происходит в самом  верхнем, гумусовом горизонте почв. Газообмен осуществляется через  систему воздухоносных пор почвы, сообщающихся между собой и атмосферой. К факторам, вызывающим газообмен, относятся:

     а) диффузия;

     б) изменения температуры почвы;

     в) изменение барометрического давления;

     г) изменение количества влаги в  почве под влиянием осадков;

     д) влияние ветра;

     е) изменения уровня грунтовых вод.

     Диффузия  газов в почве идет через поры аэрации зависит от градиента  концентрации этих газов. Динамика кислорода  и углекислого газа в почвенном  воздухе происходит почти непрерывно и зависит от типа почвы, ее свойств (физических, химических, биологических), от времени года, погодных условий  и угодья (пашня, лес, луг). На пашне  она зависит от возделываемой  культуры и применяемой агротехники. Вниз по профилю почв содержание кислорода  уменьшается, а количество углекислого  газа увеличивается.

     Особенно  большое значение на состав почвенного воздуха оказывают влага и  температура почвы. Увеличение влажности  вызывает уменьшение воздухоемкости, нарушается система воздухоносных пор, ухудшаются условия газообмена. Изменяется интенсивность биологических и биохимических процессов, что сопровождается изменением потребления кислорода и выделения углекислого газа. При оптимальной влаге с повышением температуры содержание углекислого газа в почвенном воздухе увеличивается, а кислорода – уменьшается. В летний период, при высоких температурах и влажности, близкой к влажности завядания, наблюдается самые низкие концентрации углекислого газа и высокие концентрации кислорода.

     Наблюдения  за динамикой кислорода и углекислого  газа в газовой фазе почв показывают, что взаимосвязь между составом почвенного воздуха и условиями, ее определяющими, многофакторна и сложна. Основная роль кислорода – это обеспечение дыхания растений. При недостатке кислорода дыхания растений ослабевает, уменьшается их метаболическая активность, а также энергетические ресурсы растений. Увеличение аэрации способствует улучшению развития корней, интенсивному поглощенияими воды и питательных веществ, усилению роста и повышению урожайности. Оптимальные условия для растений создаются при содержании кислорода в почвенном воздухе в пределах около 20%. Косвенно кислород влияет на почву через воздействие на окислительно-восстановительный потенциал. При его недостатке развиваются анаэробные процессы с образованием токсичных для растений соединений, снижается доступность питательных веществ, а по совокупности признаков – снижается почвенное плодородие. Аэробные процессы в верхнем горизонте почв при оптимальной температуре и влажности начинают развиваться при наличии в газовой фазе почв 2,5-5,0% кислорода. (в зависимости от содержания органики). При низких температурах или при низкой влажности (около влажности завядания), когда биологические процессы угнетены, аэробные процессы возможны и при содержании кислорода до 0,5%.

     Высокая концентрация углекислого газа оказывает  отрицательное влияние на семена, корни, урожайность растений. Углекислый газ оказывает большое значение на химическое изменение минеральной  части почвы и на накопление питательных  веществ. Почвенные растворы, насыщенные углекислым газом, оказывают растворяющее влияние на многие соединения почвы, прежде всего минеральные. Огромное количество  углекислого газа потребляется растениями в процессе фотосинтеза. Таким образом, оптимальный воздушный  режим имеет важное значение в жизни почвы и произрастающих на ней растений.

     Воздушный режим почв определяется по многим факторам, как то пористость, влажность  почвы, влагоемкость, температура, структура почвы и т.д. Для определения всех этих величин используются разные методы [7]:

     - структурный состав – метод Савинова Н. И.

     - водопрочность агрегатов – метод Бакшеева И. М.

     - пористость – метод Жидкостенасыщения. Сущность метода заключается в определении объема пустотного пространства образца (по разности масс сухого и насыщенного жидкостью образца), его внешнего объема (по разности масс насыщенного жидкостью образца в воздухе и в насыщающей жидкости) и вычислении коэффициента пористости путем деления первого объема на второй.

     В модельных опытах состав почвенного воздуха определяется на газовом  хроматографе.

     Анализ  химического состава воздуха  – газоанализатор типа «щелочь + пирогаллон А»

     Но  основным показателем воздушного режима почв является почвенное дыхание  и состав почвенного воздуха. Для  отбора проб воздуха для изучения его состава может использоваться следующий прибор: медная трубка длинною до одного метра с внутренним диаметром 5мм, при взятии проб с большей глубины (более 1 метра) целесообразнее использовать трубку с внутренним диаметром не более 3мм. К одному концу трубки приваривается медная круглая пластина, на которую устанавливается стеклянный или пластиковый колпачок с внутренним диаметром 30мм длинною около 60 мм, так, чтобы он был равноудален от медной трубки в центре. В самой медной трубке просверливается 3-4 отверстия диаметром 4мм. Пространство между колпаком и трубкой заполняется стекловатой. Трубки такой конструкции в полевых условиях расставляются на исследуемом участке группами, с расстоянием друг от друга 1м. Для установки трубок в почву пробуривают скважины примерно по диаметру «медной трубки» на необходимую глубину. Для бурения таких скважин используется винтообразный бур, причем для его извлечения используется полуторная таль, устанавливаемая на треноге. На дно скважины насыпается слой речного песка толщиной в 2-3 см. Далее устанавливается трубка и засыпается тем же песком на 2-3 сантиметра выше колпака. Далее скважина полностью заполняется почвой. Центральная медная трубка остается над уровнем почвы на 8-10 см и плотно закрывается резиновой пробкой либо колпачком. Забор проб воздуха осуществляется с помощью пипетки «Зегера» емкостью 150 см3 , смонтированном в специальном ящике. Количество пипеток берется равным количеству трубок. Для соединения пипеток между собой используются гребенки. В основной трубке просверливаются сквозные отверстия с расчетом чтобы в него прошли трубки с меньшим диаметром. Для отбора воздуха необходимо сначала выпустить небольшое количество воздуха в атмосферу, после чего осуществлять отбор пробы. Отбор проб осуществляется несколькими способами:

     1) Пробы отсасываются пипеткой, переносятся  в лабораторию, где температура  воздуха постоянна, там они  отстаиваются несколько часов,  пока температура проб сравняется  с температурой окружающей среды,  после чего они исследуются  на газоанализаторе.

     2) Полевой анализ, при котором пробы  исследуются прямо в поле, непосредственно  после отбора. Набранный из почвы  воздух будет нагреваться и  расширяться, т.е увеличиваться в объеме (при нагреве 100 см воздуха на 10С его объем увеличивается на 3,6 см ). Для устранения этих неточностей может использоваться термобарометр. В разное время суток биологическая активность почвы будет различна, поэтому данные, взятые в разные часы дня будут несопоставимы между собой. После всасывания первые пробы воздуха вытесняют трехходовым краном. Забор проб осуществляется вытеснением жидкости из пипеток в уравнительную склянку. Недостаток метода – постоянная необходимость поднимать уравнительную склянку на различную высоту с помощью подставки или вручную. Второй недостаток – при переувлажнении почвы в нижней части трубки будет накапливаться влага, освободиться от которой с помощью склянки невозможно. Для устранения этого предложено отсасывать пробы воздуха из медной трубки медицинским шприцом, объемом 200 мл.

     Для анализа могут использоваться различные  газоанализаторы. Принцип работы их всех состоит в соприкосновении  почвенного воздуха с различными поглотителями. Для поглощения углекислого газа может использоваться щелочь, например NaOH, для поглощения кислорода – щелочной раствор пирогаллона «А» [С₆Н₃(ОН)₃] 5,8% и 10%-й концентраций. Также для анализа применяются газохроматографические методы и газохроматографы с детектором электронного захвата. 

     1.3.1 Базальное и индуцированное  дыхание [8]

     Микробная биомасса является важным живым и  лабильным компонентом почвы. Ее запасы, активность и структура –  основные характеристики в экологических  исследованиях. Микробную биомассу почвы определяют прямыми микроскопическими  и непрямыми (биохимический, физиологический) методами. Первые направлены на определение числа и объем микроорганизмов (микроскопирование), вторые – на оценку их активности, например, дыхательной: после фумигации или внесения дополнительного субстрата (субстрат-индуцированное дыхание, СИД). Субстрат-индуцированное дыхание регистрирует отклик микроорганизмов после обогащения почвы глюкозой. Исследователи уделяют большое внимание результатам оценки микробной биомассы почв этими двумя группами методов.