Технология получения биопрепарата

 

Железо, цинк, медь, магний.

Важное значение в процессе развития S. griseus и образования антибиотика имеют такие элементы, как железо, цинк, медь, магний и др. Максимальный выход стрептомицина наблюдается при условии содержания FeSO₄ * 7Н2О в среде в количестве 0,0007-0,005%. Увеличение концентрации сернокислого железа до 0,05% приводит к подавлению биосинтеза антибиотика, снижению скорости потребления углеводов и к задержке развития стрептомицета. Добавление соответствующего количества фосфора к среде с избытком железа снимает неблагоприятное действие ионов железа на биосинтез стрептомицина. Вероятно, отрицательный эффект от избытка железа в среде определяется тем, что он связывает ионы фосфора. Ионы магния играют важную роль в азотном обмене актиномицета, а также в реакциях фосфорилирования. Что касается меди, то роль этого элемента в жизнедеятельности продуцента стрептомицина и образовании антибиотика не вполне ясна. Однако известно, что увеличение концентрации меди

до 50 мг% существенно не влияет на образование стрептомицина, но угнетает рост стрептомицета. Увеличение концентрации цинка и железа до 50 мг% сильно угнетает образование стрептомицина (до 50% по сравнению с

контролем).

 

 

 

Хлорид натрия.

В состав всех сред, используемых для образования стрептомицина, входит хлорид натрия NaCl. Было замечено, что без поваренной соли антибиотическая активность культуральной жидкости ниже активности этой жидкости, содержащей NaCl. В присутствии хлорида натрия увеличивается проницаемость клеточной стенки и стрептомицин легче переходит в окружающую среду. Образующийся стрептомицин не полностью выделяется в среду: определенная часть его прочно связана с клеточными стенками мицелия стрептомицета и может быть извлечена при обработке мицелия кислотой, щелочью или солью. Для выяснения роли поваренной соли в процессе биосинтеза стрептомицина были проведены опыты по выращиванию S. griseus на средах с хлоридом натрия и без него, которые показали, что содержание антибиотика действительно несколько выше в среде с NaCl. Однако при кислотной обработке мицелия в целях извлечения связанного стрептомицина оказалось, что общий выход антибиотика выше на среде, не содержащей NaCl.

Следовательно, наличие хлорида натрия в среде не способствует биосинтезу стрептомицина, а лишь облегчает выделение образовавшегося антибиотика из мицелия в среду. Аналогичную роль хлорид натрия играет в выделении из клеток микромоноспора антибиотика сизомицина.

 

Кальций.

Как элемент минерального питания кальций сам по себе не оказывает существенного влияния на биосинтез стрептомицина, однако в зависимости от состава среды он может играть положительную или отрицательную роль. Так, при стерилизации сред, содержащих фосфаты, в присутствии ионов кальция обычно ионы фосфорной кислоты связываются с кальцием в виде

нерастворимых соединений. Если в среде фосфор находится в ограниченном количестве, это снижает биосинтез стрептомицина, но при использовании сред с избыточным содержанием фосфатов внесение кальциевых солей перед стерилизацией может перевести часть фосфора в нерастворимые кальциевые соединения, т.е. создадутся условия, благоприятные для биосинтеза антибиотика.

Кроме того, ионы кальция  и магния регулируют значение рН

среды при подкислении  ее за счет остатков серной, фосфорной или других минеральных кислот при использовании аммонийных солей, например (NH₄)SO₄, (NH₄)HPO₄.

Ионы Са²⁺ активируют такие ферменты, как липазы, аденозинтрифосфатазы и некоторые другие. Они могут также ингибировать функции ферментов, активируемые магнием.

С учетом роли отдельных  компонентов субстрата в образовании антибиотика был предложен ряд химически известных синтетических сред. Эти среды успешно используются для экспериментальных исследований продуцента стрептомицина, но пока еще не пригодны для промышленного получения антибиотика. Невозможность использования синтетических сред в промышленных условиях в основном связана с тем, что они, как правило, дороже натуральных и при развитии на них стрептомицета выход стрептомицина ниже. Для промышленного получения антибиотика среда должна быть дешевой и вместе с тем обеспечивать высокий уровень биосинтеза препарата и относительно легкое его выделение. С этой целью эмпирически были предложены среды, в состав которых входят такие вещества, как соевая мука, кукурузный экстракт, сухая барда с нитратом натрия или другим неорганическим источником азота, жмыхи, земляные орехи, отходы пенициллинового производства и другие компоненты. Выбор

основного компонента среды  зависит от района, где производится антибиотик, и от сырья, которое может быть в данном случае наиболее подходящим для этих целей. Однако в большинстве случаев производство стрептомицина осуществляется в средах с соевой мукой примерно следующего состава (%): глюкоза — 2,0; соевая мука — 2,0; сульфат аммония — 0,3; фосфат калия однозамещенный — 0,05; хлорид натрия — 0,25; карбонат кальция —0,3. Изучение влияния отдельных фракций соевой муки на рост S.griseus и образование антибиотика показали, что существен-

существенную роль при  этом играют жиры и зольная часть  соевой муки. Белок сои и его  кислотный гидролизат малопригодны для биосинтеза стрептомицина.

Таблица 3 - Влияние белка, золы и жиров соевой муки на биосинтез стрептомицина культурой S. griseus (штамм JIC-1) (по Егорову, Удаловой, 1962)

Вариант опыта	Максимальное количество стрептомицина
	мкг/мл	%
Натуральная соевая мука	1770	100
Обезжиренная соевая мука	552	31
Белок соевой муки	109	6
Белок + зола соевой муки	540	30
Белок + зола + жир	781	44

Таблица 4 - Влияние гидролизата белка сои в сочетании с золой и жирами соевой муки на образование стрептомицина (по Егорову, Удаловой, 1962)

Вариант опыта	Максимальное количество стрептомицина
	мкг/мл	%
Соевая мука (контроль)	1400	100
Гидролизат белка сои	166	11
Гидролизат белка + зола	513	35
Гидролизат белка + зола + жир	938	65

 

Температура.

В развитии стрептомицета и биосинтезе стрептомицина большое значение имеет температура культивирования организма. Повышение температуры выше 30 °С практически прекращает образование антибиотика. Границы оптимума температуры для синтеза антибиотика определяются 27-29 °С.

 

Таблица 5 - Влияние температуры культивирования на образование стрептомицина и время его максимального выхода

Температура, °С	Максимальный выход стрептомицина, мкг/мл	Время максимального образования  антибиотика, ч
25	1180	118
27	2041	118
29	2194	104
31	414	72

Оптимальную температуру  для биосинтеза стрептомицина меняют в зависимости от штамма стрептомицета и состава среды.

 

Аэрация.

S. griseus — организм высокоаэробный, он поглощает значительное количество кислорода, которое зависит от состава среды и стадии его развития. В ранний период развития стрептомицета потребление кислорода воздуха происходит интенсивно, а затем падает почти до нуля. Увеличение степени аэрации повышает выход стрептомицина. Метаболизм у молодого и старого мицелия стрептомицета различен. Молодой мицелий S. griseus содержит, как правило, в 2-3 раза больше нуклеиновых кислот, чем более старый мицелий. При увеличении аэрации культуры повышается значение рН среды, т.е. быстрее разрушаются протеины. Количество кислорода, потребленного в течение опыта, в несколько раз меньше величины, необходимой для полного окисления сахара, использованного за это время. По-видимому, только часть углеводов окисляется до конечных продуктов, а основная масса остается в организме в виде запасных питательных веществ или используется на построение различных клеточных структур организма.

 

1.4 Биологическая роль.

Антибиотик широкого спектра  действия из группы аминогликозидов. Образуется в процессе жизнедеятельности лучистых грибов Streptomyces globisporus или др. видов. В низких концентрациях оказывает бактериостатическое действие: проникая внутрь микробной клетки, связывается со специфическими белками-рецепторами на 30S субъединице рибосом, нарушая образование инициирующего комплекса - матричная РНК-30S субъединица рибосомы, что приводит к распаду полирибосом, и, как следствие этого - возникают дефекты при считывании информации с ДНК, синтезируются неполноценные белки, что приводит к остановке роста и развития микробной клетки. В более высоких концентрациях оказывает бактерицидный эффект (повреждает цитоплазматические мембраны, вызывая гибель микробной клетки). Обладает широким спектром действия. Активен в отношении Mycobacterium tuberculosis, большинства грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Klebsiella spp.,Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseriameningitidis, Brucella spp., Francisella tularensis, Yersinia pestis),некоторых грамположительных микроорганизмов (Staphylococcus spp.), умеренно активен в отношении Streptococcus spp., в т.ч. Streptococcus pneumoniae,Enterococcus spp.

Устойчив в слабокислой среде, но легко разрушается в растворах крепких кислот и щелочей при нагревании. Вторичная устойчивость бактерий развивается быстро.

В комбинации с пенициллином или ванкомицином эффективен влечении эндокардита, вызываемого Enterococcus faecalis или Streptococcusviridans.

1.5 Применение:

- туберкулез различной  локализации (в т.ч. туберкулезный  менингит)

- венерическая гранулема

- туляремия

- бруцеллез

- чума

- эндокардит (в сочетании  с ампициллином)

- кишечные инфекции

- инфекции мочевыводящих  путей (после установления чувствительности  возбудителя)

2 Технология получения  биопрепарата

2.1 Физиолого-биохимические особенности развития Streptomyces griseus.

Характеризуя общие закономерности в развитии S. griseus и биохимические процессы, происходящие при этом, можно отметить две реальные фазы развития стрептомицета.

Таблица 6 – Схема двухфазного  развития стрептомицета (по И. Дулани, Д.Перлман 1947 г)

	Первая фаза	Вторая фаза
Мицелий	Быстрый рост	Постепенный автолиз
Глюкоза	Быстрое потребление	Использование оставшихся небольших количеств
рН	Постепенное повышение	Повышение до максимума
Стрептомицин	Медленное образование	Максимальная скорость образования
Растворимый углерод	Постепенное использование	Прекращение использования
Молочная кислота	Медленное образование и  использование	Медленное использование
Кислород	Максимальное потребление	Понижение потребления  до минимума
Растворимый азот	Интенсивное потребление	Увеличение концентрации
Неорганический фосфор	Максимальное потребление	Выделение в среду

 

Первая фаза. Для фазы характерны быстрый рост и развитие стрептомицета с энергичным использованием основных компонентов субстрата и максимальным потреблением кислорода. Масса мицелия достигает максимума, цитоплазма клеток базофильная, с высоким содержанием РНК, ДНК на ранних стадиях развития отсутствует и обнаруживается только через 12 ч развития. рН среды вначале несколько снижается, затем постепенно

повышается. Образование  стрептомицина незначительное.

Вторая фаза. Для этой фазы характерно медленное потребление оставшихся в среде питательных веществ. Рост стрептомицета замедляется, резко снижается потребление кислорода. Содержание РНК в мицелии падает, базофилия ядерного вещества повышается, содержание ДНК в нем увеличивается. Основная масса мицелия подвергается автолизу, что приводит к увеличению содержания в среде аммиачного азота и неорганического фосфора. Во второй фазе максимальное образование стрептомицина обычно достигается при максимуме биомассы. Иными словами, максимальное накопление антибиотика в культуральной жидкости происходит в период, когда в культуре автолитические процессы начинают преобладать над процессами роста.

 

2.2 Ферментативная деятельность продуцента стрептомицина.

Способность продуцента стрептомицина использовать сложные белковые и крахмалсодержащие соединения связана с его возможностью превращать эти соединения в более простые азот- и углеродсодержащие вещества с помощью мощного ферментного аппарата. Изучение ферментативной системы S. griseus показало, что она включает фермент амилазу, образующийся как на среде с глюкозой, так и на среде с крахмалом. Однако на среде, содержащей крахмал, активность амилазы несколько выше, чем на среде с глюкозой. Использование сложных белковых соединений, находящихся в растительных и животных продуктах (соевая мука, жмых, казеин и др.), обусловлено деятельностью активных протеолитических ферментов, которые образуются стрептомицетом в значительных количествах одновременно с биосинтезом стрептомицина. Наряду с выработкой протеолитических (казеинолитических) ферментов S. griseus синтезирует фибринолитические вещества — специфические протеиназы, способные лизировать тромбы крови.

Образование протеолитических ферментов зависит от скорости роста стрептомицета, состава применяемой среды и от штамма продуцента стрептомицина. Так, в среде с крахмалом протеиназ вырабатывается больше, чем в среде с глюкозой. При наличии в среде 4%-й глюкозы протеолитическая активность культуральной жидкости стрептомицета в течение всего процесса развития остается на более высоком уровне, чем в среде с 1%-й глюкозой. При глубинном выращивании S. griseus выделяет значительно больше протеиназ в среде с низким содержанием азота. Это, по