Технология получения биопрепарата

всей вероятности, связано  со специфической реакцией стрептомицета на понижение содержания усвояемых форм азота в среде. Кроме того, выделение протеиназ зависит от источника азота. В присутствии в среде белка образование протеиназ наиболее низкое, в среде с пептидами — высокое, в средах, содержащих аминокислоты, — еще выше. В процессе развития организма основная масса этих ферментов выделяется в окружающую среду. Оптимальное значение рН среды для проявления активности протеолитических ферментов 8-8,2. Кислая реакция (рН 4,5-5,5), а так- также сильнощелочная (рН около 9) подавляют активность ферментов.

Катионы калия стимулируют  рост актиномицета и образование протеиназ. Выделенные из культуральной жидкости S. griseus протеолитические ферменты содержат трипсин и пепсин. Из продуцента стрептомицина удалось получить протеиназу, способную гидролизовать почти все пептидные связи белков вплоть до свободных аминокислот. Необходимо отметить, что прямой зависимости между образованием стрептомицина и накоплением стрептомицетом гидролитических ферментов — протеиназ и амилаз — нет. При выращивании стрептомицета на средах, содержащих мо-

мочевину, или на соевых средах без мочевины удается обнаружить

фермент уреазу.

 

2.3 Промышленное получение стрептомицина.

Производство стрептомицина  началось в конце 1946 г., и в  течение  первого года было выпущено около 1000 кг, а уже через два года —  около 36 тонн. К настоящему времени  производство этого антибиотика  составляет не менее 300 т в год.

Увеличение производства антибиотика осуществлялось не только за счет расширения и увеличения числа  промышленных предприятий, но и благодаря  таким мероприятиям, как: 1) получение  наиболее активных штаммов стрептомицета — продуцента стрептомицина; 2) подбор наиболее

благоприятных сред и других условий культивирования продуцента, обеспечивающих высокий  биосинтез  стрептомицина; 3) разработка наиболее

рациональных методов  выделения и очистки антибиотика.

 

2.4 Получение наиболее активных штаммов стрептомицета - продуцента стрептомицина.

Селекция наиболее продуктивных штаммов S. grieus — одна из первостепенных задач в деле увеличения выхода стрептомицина. Если раньше только что выделенные штаммы продуцента стрептомицина образовывали не более 50- 100 мкг/мл антибиотика, то теперь получены штаммы, которые вырабатывают до 20 000 мкг/мл стрептомицина. В промышленных условиях используют штаммы S.griseus, способные синтезировать до 10-20 тыс. мкг/мл антибиотика. Таким образом, только за счет селекции антибиотическая продуктивность этих штаммов по сравнению с исходными повысилась в 100-200 раз. Важную роль в селекции продуцентов стрептомицина играют индуцированный мутагенез и ступенчатый отбор. Для получения мутантов широко применяют мутагенные факторы: рентгеновское и ультрафиолетовое излучения.

Обычно для получения  мутантов с повышенным образованием стрептомицина используется метод многократного облучения спор стрептомицета ультрафиолетовым светом с доведением общей дозы до 10000-20 000 эрг/мм² с последующим применением видимого света.

 

2.5 Подбор наиболее подходящей среды и установление режима развития стрептомицета.

Эти условия играют существенную роль в увеличении выхода стрептомицина. Большинство заводов, производящих стрептомицин, работают на так называемых соевых cредах, в состав которых входят соевая мука, гидрол, аммонийные соли и некоторые другие компоненты. На этих средах и при современных условиях развития стрептомицета удается достичь

высокого выхода стрептомицина. Важно отметить, что каждому вновь  выделенному в результате селекции штамму стрептомицета должны соответствовать определенная среда и свой режим для развития стрептомицета.

 

2.6 Метод выделения и очистки стрептомицина.

С помощью этого метода определяют как количество получаемого  антибиотика, так и его качество. Чем лучше очищен препарат от балластных веществ, тем выше его миллиграммовая активность и выше лечебные качества. Благодаря использованию совершенных  методов выделения и очистки  стрептомицина удается получить препараты, содержащие до 800 мкг/мг и  более стрептомицина с выходом  антибиотика до 95-97%.

 

Выделение стрептомицина  из культуральной жидкости

Стрептомицин — сильно полярное органическое основание.

По структуре стрептомицин представляет собой сложную молекулу с большим числом гидрофильных и  функциональных групп. Гуанидиновые группы в стрептидиновой части молекулы и метилиминная группа в N-метилглюкозаминной части молекулы антибиотика обусловливают его сильные основные свойства. Стрептомицин в виде свободного основания или в виде солей неорганических кислот хорошо растворим в воде. Однако соли неорганических кислот стрептомицина нерастворимы почти во всех органических растворителях. Это обстоятельство имеет важное значение при разработке метода выделения антибиотика. Так, попытки экстрагировать стрептомицин из водных растворов при рН от 2 до 9 бутиловым спиртом или другими известными не смешивающимися с водой растворителями не увенчались успехом. Поэтому метод экстракции данного антибиотика

не нашел применения.

Основная масса антибиотика  выделяется в культуральную  жидкость. Однако часть стрептомицина остается в мицелии и на его поверхности. Поэтому культуральную жидкость вместе с биомассой обрабатывают минеральной кислотой, для того чтобы весь антибиотик перевести в раствор. После этого мицелий отделяют  с помощью фильтр-прессов или центрифуг, а свободную от мицелия культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой для удаления белков и органических оснований, а также ионов металлов (кальция, железа, магния и др.). Из полученных таким образом растворов выделяют стрептомицин.

 

Метод адсорбции  на активированном угле.

Метод основан на том, что  при кислой реакции раствора (рН 2-4) стрептомицин не адсорбируется на частицах активированного угля, в то время как ряд примесей при таком значении рН адсорбируется. Стрептомицин садится на уголь при нейтральном или слабощелочном

значении рН. Концентрирование стрептомицина методом адсорбции на угле

проводят следующим способом. Культуральную жидкость подкисляют до рН 2-4 и смешивают с активированным углем. Затем уголь отделяют, а обесцвеченную жидкость нейтрализуют щелочью до рН 7-7,5 и снова смешивают с новой порцией аактивированного угля, который после этого автоматически подается на фильтр-пресс. Остатки неактивной жидкости отделяют, а адсорбированный на угле стрептомицин промывают при нейтральной реакции водой и нейтральным спиртом для удаления раствори-

растворимых в спирту примесей.

Десорбцию (элюцию) стрептомицина с угля осуществляют с помощью кислого спирта, приготовленного с соляной кислотой. В этих условиях многие примеси остаются адсорбированными на угле. После элюции к раствору добавляют сухой серный эфир — в осадок выпадает солянокислая соль стрептомицина. Существуют и другие модификации адсорбционного метода выделения стрептомицина.

 

 

 

Метод с применением  ионообменных смол.

Стрептомицин и другие аминогликозиды выделяют из культуральной жидкости, как правило, сорбционным методом с использованием карбоксильных катионитов. Метод основан на использовании катионообменных смол (катионитов) типа сополимеров акриловой или метакриловой кислот и дивинилбензола. Раствор стрептомицина пропускают через ряд колонн, заполненных катионитом. Стрептомицин садится на смолу. Адсорбированный антибиотик обычно вытесняют водными растворами минеральных кислот. В растворе содержится высококонцентрированный и весьма очищенный препарат стрептомицина.

 

2.7 Стабильность стрептомицина.

Стабильность стрептомицина  зависит от чистоты препарата, влажности, температуры, кислотности растворителя. Установлено, что химически чистый стрептомицин устойчив как в сухом состоянии, так и в виде растворов. Соли стрептомицина при хранении их при комнатной температуре инактивируются лишь в незначительной степени, и притом на протяжении нескольких лет. Даже при температуре 50°С соли стрептомицина сохраняются в течение длительного времени. Максимум стабильности растворов гидрохлорида и сульфата стрептомицина находится при значении рН в пределах от 3,0 до 7,0 при температуре от 7 до 25°С. Соли стрептомицина, поступающие в продажу, содержат менее 3% влаги и устойчивы при хранении в условиях комнатной температуры в течение длительного времени — до трех лет, считая со дня их выпуска, а растворы сульфата стрептомицина — до 1,5 года.

 

2.8 Зависимость антибиотической активности стрептомицина от рН среды и ее состава

Антибиотическая активность стрептомицина в большой степени  зависит от рН среды и ее состава. В кислых средах действие стрептомицина  значительно снижается. В щелочных условиях среды проявляется максимальная биологическая активность антибиотика. Так, активность при рН 5,8 примерно в 20-80 раз меньше, чем при рН 8,0.

Данные, представленные в таблице 7, показывают, что для подавления развития определенного количества клеток какого-либо чувствительного к стрептомицину микроба в условиях слабокислой среды необходимо в 4 раза больше, а для Salmonella typhi — почти в 70 раз больше антибиотика по сравнению с количеством стрептомицина, действующим при щелочных условиях (рН 8,0). Для проявления максимальной антимикробной активности

стрептомицина оптимальное  значение рН 7,5-8,0. Присутствие некоторых  веществ в среде иногда значительно влияет на антибиотическую активность стрептомицина. Так, если к мясопептонному бульону прибавить 0,5-3% хлорида натрия, хлорида калия или сульфата натрия, то Е. coli даже при наличии в среде 10 мкг/мл стрептомицина будет развиваться, тогда как

без добавки этих веществ для подавления роста бактерии достаточно 0,3 мкг/мл антибиотика.

Таблица 7 - Влияние рН среды на антибиотические свойства стрептомицина (по Abraham, Duthie, 1946)

Микроорганизм	Бактериостатическая концентрация стрептомицина, мкг/мл, при разном значении рН среды
	6,0	7,4	8,0
Escherichia coli	150	25,0	3
Salmonella typhi	200	12,0	3
Proteus vulgarls	100	25,0	25
Staphylococcus aureus	100	25,0	12
Streptococcus pyogenes	5	2,5	1

Иными словами, присутствие  в среде вышеназванных солей  снижает антибактериальную активность стрептомицина в 33 раза. При наличии  в среде поваренной соли уменьшаются  скорость и степень диффузии стрептомицина, а также снижается адсорбция  антибиотика бактериальной клеткой. Ряд органических соединений, присутствующих в среде, снижает антибактериальные  свойства стрептомицина. К ним относятся  нуклеиновые кислоты, пептон, сыворотка  крови, аминокислоты, глюкоза, некоторые  соли органических и неорганических кислот. Например, добавление к среде  солей пировиноградной  или фумаровой кислот в концентрации 1% создает условия, при которых Е.coli развивается в присутствии 10 мкг/мл стрептомицина, а если концентрацию солей повысить до 3%, то рост бактерий наблюдается и при 150 мкг/мл антибиотика. Защитное действие этих и некоторых других кислот специфично.

Стрептомицин в этих условиях не разрушается, но возрастает устойчивость бактерий к нему. У Е. coli такая устойчивость проявляется в большой степени, в то время как у Staph. aureus эти кислоты почти не вызывают защитных свойств. Сильно снижается антибиотическая активность в присутствии цистеина и гидроксиламина. Так, цистеин полностью инактивирует стрептомицин в течение нескольких часов. В анаэробных условиях также наблюдается снижение антибиотических свойств стрептомицина в отношении таких организмов, как Е. coli, Proteus

vulgaris, Enterobacter aerogenes и некоторых других.

По всей вероятности, ослабление действия стрептомицина в данных условиях в определенной степени  связано с образованием кислот и, следовательно, с понижением значения рН среды. Подавление антибиотического действия стрептомицина in vitro  происходит также под действием вещества, образуемого в культурах Pseudomonas aeruginosa. Это вещество оказалось ингибитором неомицина и дигидрострептомицина. Влияние ингибитора не связано с разрушением молекулы стрептомицина. В опытах на животных ингибитор не проявляет своего действия на активность стрептомицина.

Таким образом, антибиотические  свойства стрептомицина в большей  степени определяются кислотностью среды и ее составом. Поэтому определение  чувствительности микроорганизмов  к действию названного антибиотика  или его количественное определение  биологическими методами необходимо проводить  при строго определенных условиях среды, способствующих наивысшему проявлению антибиотических свойств стрептомицина.

 

3 Собственные исследования

3.1 Материалом для работы послужили:

- Образцы почвы для  выделения актиномицетов

- Питательная среда Симонса

- Питательная среда Сабуро

- Питательная среда Эндо агар

Данная работа начало и окончание исследований проходили в лабораториях НИИ биотехнологии при Казахском Агротехническом университете.

В работе были использованы следующие методы исследования:

При выполнении настоящей  работы применялись микологические, морфологические и статические  методы исследования.

Изготовление питательных  сред. Среды готовили путем двойного кипячения в объеме 100 мл.

Внесение посевной культуры. Посев на плотные питательные среды проводился касанием бактериальной петлей.

 Первым этапом данной работы был сбор образцов почвы, затем замачивание почвы водопроводной водой и растирание пестиком в ступке.

Затем приготовили питательные  среды Сабуро и цитратный агар Симонса и разлили в 4 чашки Петри.