Определение значения активности креатинина и мочевины в сыворотке крови у кошек, страдающих пиелонефритом

 

1.7. Клинико-диагностическое значение креатинина в крови

Повышение уровня креатинина в крови:

• острая и хроническая почечная недостаточность;
• акромегалия и гигантизм;
• прием нефротоксических препаратов (соединений ртути, сульфаниламидов, тиазидов, антибиотиков из группы аминогликозидов, цефалоспоринов и тетрациклина, барбитуратов, салицилатов, андрогенов, циметидина, триметоприм-сульфометоксазола);
• механические, операционные, массивные поражения мышц;
• синдром длительного раздавливания;
• лучевая болезнь;
• ложное повышение: возможно при увеличенной концентрации в крови некоторых эндогенных метаболитов (глюкоза, фруктоза, кетоновые тела, мочевина, некоторых лекарств – аскорбиновой кислоты, леводопа, цефазолина, цефаклора, резерпина, нитрофуразона, ибупрофена);
• преобладание мясной пищи в рационе;
• гипертиреоз;
• обезвоживание.

Понижение уровня креатинина в крови:

• голодание, снижение мышечной массы;
• прием кортикостероидов;
• беременность;
• вегетарианская диета;
• гипергидратация;
• миодистрофии [18].

Ниже представлена таблица  референтных значений содержания креатинина и мочевины в сыворотке крови у кошек в норме.

                                                                                                                 Таблица

Референтные величины содержания креатинина и мочевины в сыворотке крови кошек

Норма	Креатинин	Мочевина
	44-160 мкмоль/л	4-10 мммоль/л

 

Одновременное повышение показателей креатинина и мочевины в сыворотке крови  приводит к возникновению пиелонефрита.

 

 

 

 

 

 

2. Экспериментальная часть

 

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Объект исследования

Объектом исследования являлась кровь животных (кошек). Было обследовано 15 домашних животных, различных пород. Согласно предварительно проведенных исследований животных, был установлен  диагноз – заболевание почек.

Определение концентрации мочевины в сыворотке крови осуществляли общепринятым методом, предложенного фирмой «Витал» Диагностикс СПб (Россия).

Определение активности креатинина проводилось по методу Яффе.

Настоящая работа проводилась в условиях ГНУ Научно-исследовательской ветеринарной станции (НИВС) г. Самары.

 

2.1.2. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови

Определение концентрации мочевины в сыворотке крови кошек осуществляли общепринятым методом.

Принцип метода заключается в том, что мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

Определение данного  биохимического показателя проводили  с применением стандартного набора реактивов фирмы «Витал Диагностикс  СПб» (Россия).

Анализ проводился в кюветах – 0,5 см, при длине волны 540нм.

Состав набора:

1. Стандартный раствор мочевина – 16,65 ммоль/л,                 

2. Диацетилмонооксим  – 10 таблеток.

Состав реакционной  смеси:

Диацетилмоноксим  – 5,0 ммоль/л

Тиосемикарбазид  – 0,9 ммоль/л

Кислота серная – 0,9 моль/л

Соль железа трехвалентного  – 25,0 мкмоль/л

Соотношение сыворотка/реакционная смесь   – 1/121

Референтные величины:

Мочевина (мкмоль/л) – 7,1-15,0

 Приготовление  рабочих растворов:

Раствор№1: В  мерной колбе вместимостью 50 мл растворяли в 30 мл дист.воды при повышенной температуре одну таблетку Реактива 2. После охлаждения доливали водой до метки. Наличие небольшого количества нерастворимого осадка не мешало определению.

Раствор №2: Приготавливали смешиванием 1 доли Раствора 1 с одной долей раствора серной кислоты.

Устойчивость:1 день (с +15 до +25)⁰С

Анализ определения  концентрации мочевины проводили по следующей схеме (таблица 2.1.):

Схема проведения анализа определения  активности мочевины в сыворотке крови

Т аблица 2.1.

Отмерить	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольный раствор
Сыворотка	0,02	–	–
Калибратор	–	0,02	–
Рабочий раствор	2,0	2,0	2,0
Раствор серной                  кислоты	2,0	2,0	2,0
Дистилированная вода	–	–	0,02

 

В трех тонкостенных пробирках смешивали  растворы соответственно вышеприведенной таблицы. Отверстие пробирки закрывали алюминиевой фольгой и помещали в водяную кипящую баню точно на 10 минут. Через 10 минут пробирки быстро охлаждали проточной водой и измеряли  оптическую плотность пробы и калибровочной пробы. Измерение проводили против контрольного раствора (холостая проба). Пробу измерили в течение 15 минут после охлаждения.

Расчет проводился по формуле:

Мочевина= 16,65*А(о)/А(к)

Где: А(о) – оптическая плотность опыта

А(к) – оптическая плотность калибровочного раствора.

16,65 – концентрация  мочевины в растворе калибратора.

 
2.1.3. Определение концентрации креатинина в сыворотке крови

Осуществляли  методом Яффе, предложенного  фирмой  «Витал» Диагностикс СПб.

Принцип метода заключается в том, что креатинин в щелочной среде образует с пикриновой кислотой окрашенный комплекс.

Определение данного  биохимического показателя проводили  с применением стандартного набора реактивов фирмы «Витал Диагностикс  СПб» (Россия).

Состав набора: 

Реагент № 1 – пикриновая кислота  - 35 ммоль/л  

Реагент № 2 – натрий едкий - 0,75 моль/л 

Реагент № 3 – креатинин - 177 мкмоль/л 

Реагент №4 – трихлоруксусная кислота(ТХУ) – 1,2 моль/л

Аналитические характеристики набора: 

Линейность  – отклонение не более  8 %

до концентрации 440 мкмоль/л.

Чувствительность  – не более 40 мкмоль/л

Коэффициент вариации –  не более 8 %

Время проведения анализа – 45 мин. 

Анализ проводили:

 При длине волны: 505 нм (ФЭК – 490 нм).

Длине оптического пути: 1 см.

Температуре инкубации : 25°С

Фотометрирование проводили против холостой пробы. 

Анализ определения концентрации креатинина проводили по следующей  схеме (таблица 2.2. и таблица 2.3.):

 

Схема проведения анализа определения  активности  креатинина в сыворотке крови

Таблица 2.2.

	Проба № 1 (сыворотка, плазма)	Раствор для  холостой пробы
Сыворотка	0,5 мл	–
Бидистиллиро- ванная вода	1,0 мл	0,75 мл
Реагент № 4	0,5 мл	0,25 мл

 

 

 Пробы перемешали, и инкубировали 10 мин при 18-25 °С.

Пробы №№ 1 и 2 центрифугировали в течение 12-15 мин при 900г. Раствор для холостой пробы не центрифугировали.

Прозрачный  супернатант использовали для дальнейшего  анализа. Супернатант может храниться 7 суток при температуре 2-4°С.

 

 

 

 

 Схема проведения анализа  определения  активности  креатинина в сыворотке крови

 

Таблица 2.3.

	Проба № 1	Калибр.проба	Холостая проба
Супернатант	1,0 мл	–	–
Раствор для  холостой пробы	–	–	1,0 мл
Реагент № 3	–	1,0 мл	–
Реагент № 2	0,5 мл	0,5 мл	0,5 мл
Реагент № 1	0,5 мл	0,5 мл	0,5мл

 

 

Пробы перемешали и  инкубировали точно 20 мин при 25°С.  Затем фотометрировали.

Расчет концентрации креатинина (С) проводили по формуле:

С= А_{оп 1}/А_кал´ 177 [мкмоль/л],

где:  А_{оп 1} – адсорбция опытной пробы,

А_кал– адсорбция калибровочной пробы,

177 моль/л – концентрация креатинина в калибраторе.

 

2.1.4. Статистическая обработка результатов

Полученные  данные подвергались статистической обработке, учитывались ошибки при  разбросе данных.  Проводилась проверка данных на соответствие нормальному распределению  с использования критерия Стьюдента [19]. Статистическая обработка данных производилась на IBM-PC с применение современных технологий компьютерного анализа данных.

 

 

 

2.2. Результаты исследований и обсуждение

В результате проведённых  исследований в условиях ГНУ НИВС г. Самара были сформированы группы животных(кошек) входящие в референтные значения и выходящие за их пределы.  Пределы референтных значений были выданы НИВС. Сформированные значения представлены  в таблице 2.4.

 

Повышенное  содержание мочевины и креатинина в  сыворотке крови исследованных кошек.

 

Таблица 2.4.

 

№ исследованного животного	Креатинин мкмоль/л	Мочевина мммоль/л
1	718,6	46,0
2	290,0	18,0
3	202,4	10,6
4	563,4	70,4
5	271,6	16,2
6	253,2	13,2
7	245,3	15,8
8	165,3	13,7
9	161,6	47,0
10	185,5	16,7
11	1253,8	58,8
12	421,8	20,9
13	Норма	12,3
14	202,4	Норма
15	Норма	15,5

 

 

 

 

 

Всего было исследовано 15 больных кошек. По повышенным показателям креатинина, мы выявили три группы животных и посчитали среднее значение показателей.

1 группа –  от 161 до 184

2 группа –  от 185 до 297

3 группа – от 298 до 846

 

Ниже представлен  рис.2.1, где приведены значения каждой группы животных.

Рис 2.1. Среднее значение концентрации креатинина в группах животных с патологией – пиелонефрит.

В обработке  полученных данных были сформированы группы, по содержанию мочевины в сыворотке.

Группа 1 – от 10 до 12

Группа 2 – от 13 до 22

Группа 3 – от 23 до 56

 Группы представлены ниже на рисунке 2.2.

 

Рис.2.2. Значение концентрации мочевины в группах животных с патологией – пиелонефрит.